甜菜BvMTP11基因的克隆及序列分析

王锦霞 ，李硕 ，代春艳 ，马龙彪 ，刘大丽

（1.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；2.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点实验室/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080；3.黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨150080）

0 引言

长期累积并隐藏于土壤中的包括Cd、Zn、Cu等在内的重金属离子，当它们含量达到或超过一定程度后，会导致细胞内生物大分子失活、阻碍蛋白质功能或取代其它必需营养元素，进而影响植物的生长发育并对其产生毒害[1]。植物在长期的进化适应过程中也相应地产生了一系列包括螯合、外排和区隔等在内的作用机制以降低重金属离子毒害。一般情况下，为了避免细胞伤害，植物会利用低分子量复合物螯合重金属离子，进而将其区隔到细胞器或通过特异的转运子排出到细胞间隙[2]。在众多的金属转运子中，金属耐受蛋白（Metal tolerance proteins，MTPs）作为植物中一类重要的阳离子扩散促进子（Cation Diffusion Facilitator，CDF）家族成员，直接或间接地参与到重金属离子的调控和代谢过程中。研究表明，无论是在拟南芥（Arabidopsis thaliana）还是超累积植物鼠耳芥（A rabidopsishalleri）或蓝菜（Noccaea caerulescens）体内，其液泡中大量的金属离子的区隔均与MTPs的作用直接相关[3-4]。

通过系统进化分析，在植物体内，MTPs被划分为七个小组。其中，Group 1、5、12小组属于Zn-CDFs；Group 6、7小组属于Fe/Zn-CDF家族；而Group 8、9小组被推测为Mn-CDFs家族[5-6]。大多数CDFs蛋白在N和C末端之间有6个左右的跨膜结构域（Transmembrane domains，TMDs）。存在于第四、第五个TMD或者碳氮末端的高丰度组氨酸区域，被推测可能作为金属结合域（Metal binding domain）与重金属离子识别相关[7]。研究表明，隶属于Group 1的AtMTP1、AtMTP3作为Zn的转运子在液泡中发挥功能[8]；而在Group 8和9中，AtMTP11定位于trans-Golgi或pre-vacuolar compartment[9]。在Mn离子胁迫下，只有AtMTP11基因呈现出大量的诱导表达。同时该基因的缺失突变体对Mn高度敏感，并且在其叶片部位可以检测到大量Mn离子的存在。过量表达AtMTP11基因同时可以提高酵母和拟南芥对Mn离子的耐受性[9-10]。由此可以推断，AtMTP11可能通过囊泡的运输以及胞吐作用外排过量的Mn以降低重金属离子带来的细胞毒害。在水稻体内，OsMTP11可以在不同程度上补偿酵母突变体对于Mn、Co、Ni的敏感性，并且该基因的表达分别受到了Mn、Zn、Ni、Cd的诱导调控；通过洋葱表皮细胞瞬时表达发现，OsMTP11-GFP在液泡膜上的表达更为强烈，这也暗示了该基因参与重金属离子的区隔化[11]。

甜菜是我国重要的糖料作物之一，重金属逆境严重影响其生长发育以及品质产量[12]。在前期的相关研究[13-14]，以及对甜菜在重金属逆境胁迫下的转录组测序分析过程中，本课题小组发现了一系列与重金属逆境诱导相关的差异表达基因，其中，BvMTP11基因无论在甜菜叶片还是根部的表达都极其显著。因此，为了进一步了解BvMTP11在甜菜体内的功能以及其在重金属离子代谢平衡中的分子机制，本研究利用RT-PCR克隆了甜菜BvMTP11基因，并对该基因进行了较为全面的生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

甜菜780016B/12优，由国家甜菜种质资源中期库（国家甜菜种质资源平台）提供。取4片真叶期的甜菜幼苗组织，用于总RNA的提取以及基因克隆。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA的提取

称取1 g甜菜幼苗组织，通过Trizol（Invitrogen）法提取甜菜的总RNA。利用紫外分光光度计NavoVue plus在OD260和OD280下，测定RNA浓度及纯度。1.0%Agarose electrophoresis进一步检测RNA的质量。

1.2.2 cDNA反转录及PCR扩增

取1μg总RNA，利用First strand cDNA synthesis kit（TOYOBO）将其反转录为cDNA。根据甜菜Beta vulgaris metal tolerance protein 11（BvMTP11，LOC104886952）基因的碱基序列设计引物：[Forward primer(5′-3′):CGGGATCC(BamHI)A TGGGGGAAA TGGTCA GACTC;Reverse primer(5′-3′):CGCTCGAG(XhoI)C TAT AGA TGGGCT TGCGCA TG；Tm=65℃；扩增片段长度为1 242 bp]。以cDNA为模板，利用KOD-Plus-Neo高保真酶（TOYOBO）PCR扩增该基因CDS全长。

1.2.3BvMTP11基因的克隆

取4μL PCR产物，于25℃连接到载体pEASY-Blunt（TransGen）上，并转化到Trans1-T1感受态细胞中。通过IPTG诱导和X-gal底物显色以及Amp抗性筛选，选择阳性重组子质粒DNA，并利用BamHI和XhoI进行限制性内切酶酶切和PCR鉴定。所获得的阳性克隆进一步于上海生工测序，确定其序列的完整性。

1.2.4 生物信息学分析

利用NCBI数据库的ORF Finder分析BvMTP11基因的开放读码框和CDS，利用Conserved Domains Database（CDD）分析该基因所编码蛋白的保守结构域。利用ProtParam软件计算目的蛋白的分子量和等电点。通过SignalP-5.0、ProtScale以及TMHMMServer 2.0分别来预测该蛋白的信号肽、亲疏水性和跨膜结构域的分布情况。利用PSORT预测蛋白的亚细胞定位。

2 结果与分析

2.1 甜菜BvMTP11基因的克隆

根据Beta vulgaris metal tolerance protein 11(BvMTP11，LOC104886952）基因的碱基序列，设计该基因CDS两端的特异引物，并在起始密码子和终止密码子两端分别引入BamHI和XhoI酶切位点，以甜菜总RNA反转录的cDNA为模板扩增目的基因。如图1-A所示，经过琼脂糖凝胶电泳的检测，甜菜总RNA具备了较高的完整性和纯度。通过RT-PCR技术，利用高保真Taq酶扩增BvMTP11基因，在1.24 kb左右的位置获得了目的条带（图1-B）。此PCR产物与目的基因在Genbank里的序列大小相一致，无杂带，可以直接用于下一步的载体构建。将BvMTP11基因的PCR扩增产物连接到克隆载体pEASY-Blunt上。研究表明，经过大肠杆菌转化、重组质粒的提取以及BamHI、XhoI限制性内切酶酶切，在1%的Agarose凝胶的3.93 kb和1.24 kb的位置上，获得了相对应于载体pEASY-Blunt和目的基因片段BvMTP11的条带（图2-A）；同时，利用特异引物PCR扩增重组质粒，在大约1.24 kb左右的位置获得了目的条带（图2-B）。将阳性重组质粒pEASY-Blunt-BvMTP11测序，通过与该基因的Genbank数据信息对比，最终确定了克隆的正确性。

图1 甜菜BvMTP11基因的RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCR amplification of BvMTP11 gene

2.2 甜菜BvMTP11基因的生物信息学分析

甜菜BvMTP11基因的CDS全长为1 227 bp，编码408个氨基酸（图3）。根据ProtParam分析计算，该基因所编码蛋白的分子量（Molecular weight）为45.935 kDa，等电点（Theoretical pI）为4.89。该蛋白的不稳定指数（Instability index）为43.21，属于不稳定蛋白。根据SignalP-5.0分析该蛋白没有信号肽，不属于分泌蛋白。

图3 甜菜BvMTP11基因序列信息Fig.3 Beta vulgaris BvMTP11 gene sequence

根据ProtScale预测，BvMTP11基因所编码蛋白的亲水性最低值为-3.289，最高值3.122，因此推测该蛋白为亲水性蛋白。利用TMHMMServer 2.0对该基因的蛋白跨膜结构域进行预测，如图4所示，该蛋白有5个跨膜螺旋区，横跨细胞器和细胞质，属于跨膜蛋白。PSORT预测该蛋白有80%的可能性定位于过氧化物酶体。NCBI保守结构数据库CDD分析发现，在BvMTP11蛋白的C末端附近存在阳离子排出域（Cation efflux domain）（图5）。这些结构暗示了该基因可能作为转运蛋白参与到甜菜重金属离子的解毒代谢过程中。

图4 甜菜BvMTP11蛋白的跨膜螺旋区预测Fig.4 Prediction of transmembrane helices in BvMTP11

图5 BvMTP11蛋白的保守结构域分析Fig.5 Conserved domain assay of BvMTP11

3 讨论

逆境胁迫过程中，离子代谢平衡对于植物细胞至关重要。生物体内有许多基因家族都参与到重金属离子的吸收和转运过程中[15]。在植物中，MTPs是一类重要的金属转运子。然而，与包括转录因子以及激酶在内的其他基因家族相比，MTPs在重金属逆境胁迫过程中的特性及功能还有待更加深入的了解。

重金属逆境会导致甜菜的生长发育在一定程度受到影响[12]。前期通过转录组学RNA-Seq的分析发现，在胁迫应答过程中，甜菜BvMTP11基因的表达极其显著。因此，本研究利用RT-PCR技术克隆了BvMTP11，并结合生物信息学数据库分析和预测了该基因的生物学结构和特性。由于MTPs属于阳离子扩散促进家族（Cation diffusion facilitator family，CDF）。CDF家族成员一般有几个独特的结构：1个N端的特异信号序列、4～6个跨膜结构域（Transmembrane domains，TMDs）、1个富含组氨酸的胞质环（Cytoplasmic loop）、1个大的阳离子排出域（Cation efflux domain）以及质膜碳末端（Cytoplasmic C-terminus）[16]。因此，甜菜BvMTP11蛋白的离子外排结构域以及5个跨膜螺旋结构域的存在也说明了该基因具备了重金属离子结合和转运的功能。同时，该基因的全长CDS序列的克隆也为下一步深入细致研究其在重金属逆境胁迫下的底物特性、亚细胞定位、组织学表达特性奠定基础，为进一步提高甜菜对重金属逆境的耐受性以及利用生物技术来改造或在生物修复方面的应用提供了候选基因。