生物活性玻璃促进大鼠口腔溃疡愈合疗效观察

马聪聪， 郑赛巍， 彭 健， 何 园

(1. 同济大学口腔医学院，上海 200072； 2. 同济大学附属口腔医院口腔黏膜病学教研室-上海牙组织修复与再生工程技术实验中心，上海 200072)

复发性口腔溃疡(recurrent oral ulcer, ROU)，又称复发性阿弗他溃疡(recurrent Aphthous ulcer, RAU)，是临床上最常见的口腔黏膜疾病，疼痛明显，严重影响患者的生活质量。目前尚缺乏有效的根治方法,一般以局部治疗为主，用于减轻疼痛和预防继发性感染，但常规应用的临床药物具有一定的副作用[1]。生物活性玻璃(bioactive glasses, BG)是一种新型的生物材料，可促进机体组织的修复、替代与再生[2]，近年研究发现其对促进难治性皮肤溃疡愈合有一定疗效，但尚未见BG促进口腔溃疡愈合的研究。本实验建立SD大鼠口腔溃疡模型，研究BG药物制剂是否具有促进口腔溃疡愈合的作用，并与糖皮质激素类药物曲安奈德软膏的进行比较，为BG应用于口腔溃疡的治疗奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年SD雄鼠60只，无特异病原体级(SPF)，体质量250～330g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号： SCXK(沪)2013-0016，饲养环境室温20～25℃，日温差≤3℃，换气次数10～20次/h，湿度40%～70%，昼夜明暗交替时间12h/12h。

1.2 药品与试剂

45S5BG成分： Na2O 24.5%，CaO 24.5%，P2O56.0%，SiO245%(均为质量百分比)；曲安奈德口腔软膏(5g，澳美制药厂,医药产品注册证号HC20120023)。聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素纳(CMC Na)购自美国Sangon Biotech公司。

1.3 药物制备

BG膜： 在烧杯中混合45S5BG 3g，PVA 3g，CMC Na 1.5g，甘油3mL，加蒸馏水至60mL，70℃水浴加热30min。待药物充分搅拌混匀后，在10cm×10cm玻璃皿上铺成薄膜，自然干燥后，剪切成2cm×2cm药膜备用。

空白的PVA膜： 在烧杯中，混合PVA 3g，CMC Na 1.5g，甘油3mL，加蒸馏水至60mL，70℃水浴加热30min。同上述方法前切成2cm×2cm空白膜备用。

1.4 实验方法

60只SD大鼠实验室适应性喂养1周，使用2%戊巴比妥钠(40mg/kg)进行腹腔注射麻醉，使用“外科创伤+甲醛甲酚(formocresol, FC)灼烧(0.05mL FC灼烧60s)”法于下切牙区唇侧牙龈处制造椭圆形面积约为15mm2的溃疡。大鼠随机分为4组： A组BG膜组，使用2cm×2cm 45S5 BG膜黏附于口腔溃疡表面；B组曲安奈德组，使用曲安奈德软膏均匀涂布于口腔溃疡表面；C组空膜组，使用空白的2cm×2cm PVA膜黏附于口腔溃疡表面；D组空白对照组，溃疡表面不使用任何药物处理。于造模后0、3、6、9、12、15d观测溃疡面积，用相机拍照，并在每次观测后，使用相应药物覆盖创面(麻醉苏醒前确认药物未脱落)。记录溃疡形态及愈合情况，用Matlab R2017b软件(美国Mathworks公司)编辑计算溃疡面积以及溃疡面积变化率。溃疡面积变化率=(初始溃疡面积-现溃疡面积)/初始溃疡面积×100%。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0软件对结果数据进行统计学分析，使用多组重复测量数据方差分析方法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠口腔溃疡变化的观察

建立溃疡模型时(0d)，可见椭圆形的口腔溃疡出血面及少许褐色灼伤，第3天溃疡面积最大，呈椭圆形，由黄白色纤维膜覆盖，周围黏膜伴有红斑晕。第6天溃疡中央为黄白色假膜黏膜，周围黏膜充血水肿明显，溃疡面积减小。第9～12天溃疡面积逐渐缩小至愈合，黏膜充血水肿也逐渐减轻。见图1。

2.2 各组大鼠口腔溃疡面积变化率变化趋势的比较

造模第3天时，曲安奈德组面积变化率最高；在第6～15天的A组面积变化率一直高于B组，且在4组中最高。第6天前，C组面积变化率低于B组，但第6～12天，B组与C组面积变化率接近。见图1～2。

造模第3天，A组与B组的溃疡面积均有一定程度减小，与D组对比差异有统计学意义(P<0.05)，B组面积变化率高于A组，但二者间差异无统计学意义；C组的溃疡面积变化不大，而D组的溃疡面积有进一步增大的现象。

第6、9天，A组面积变化率与D组、B组相比差异有统计学意义(P<0.05)；第12天，A组面积变化率与其他3组相比差异均有有统计学意义(P<0.05)。第6、9、12天B组面积变化率与C、D组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 各组大鼠口腔溃疡的愈合情况观察Fig.1 Changes of oral ulcer areas in different groupsA： 45S5生物活性玻璃膜组；B： 曲安奈德组；C： 空膜组；D： 空白对照组

图2 不同时间点各组大鼠口腔溃疡面积变化率的比较Fig.2 Changes rate of oral ulcer areas in different groupA： 45S5生物活性玻璃膜组；B： 曲安奈德组；C： 空膜组；D： 空白对照组；*P<0.05

3 讨 论

ROU为周期性发生的口腔黏膜疾病，患病率居口腔黏膜病之首，常见于唇、舌、颊黏膜、前庭沟、软腭等缺乏角化层或角化较差部位，典型病变是圆形到椭圆形的溃疡，由黄白色纤维膜覆盖，周围有红斑晕。ROU通常产生明显灼痛感，影响患者进食与口腔卫生护理，感染风险提高，严重影响患者生活质量[3]，目前尚缺乏有效的根治方法。国内常规治疗包括局部或全身用药来减轻疼痛和预防继发性感染。临床用于局部治疗的药物包括抗炎药、抗菌剂、抗生素、麻醉药和糖皮质激素[4]。但糖皮质激素的长期使用常伴随着严重且不可逆转的副作用，如局部菌群失调、表皮萎缩、组织修复障碍、组织愈合延缓[5]。漱口水长期使用可导致口腔黏膜和硬组织的着色，并影响口腔环境微生态的平衡等[1]。因此，寻找适宜的治疗口腔溃疡的药物一直是颇受关注的研究方向。

软组织溃疡愈合过程包括出血、炎症、增殖和组织重塑[6]。从损伤开始，损伤的血管和脱粒血小板立即释放出不同的生长因子、细胞因子和低分子量化合物，如血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、血管生成素、胰岛素样生长因子、神经生长因子等[7]。当这些生长因子和细胞因子发生改变，软组织的创伤愈合过程将会出现相应的改变[8]。血管被破坏后会形成血凝块，血凝块可为入侵微生物提供屏障并作为迁移细胞的基质，提供愈合过程后期所需的生长因子。在受伤的初期，炎症细胞迅速迁移进入受伤区域[9]。而正常伤口愈合的重建以外基质的变化和成熟为标志，如蛋白聚糖和胶原蛋白的沉积。在炎症初期，糖皮质激素通过抑制毛细血管扩张，减轻渗出和水肿，又通过抑制白细胞的浸润和吞噬从而减轻炎症。但是，糖皮质激素通过减少细胞的有丝分裂率诱导皮肤成纤维细胞的抗增殖作用，并明显干扰细胞外基质蛋白的产生，减少胶原蛋白mRNA表达和蛋白质合成，不利于增殖和组织重塑。本实验中曲安奈德在溃疡愈合的早期，即溃疡前3d促进愈合效果明显，而在溃疡愈合的后期，即第6～12天曲安奈德组面积变化率与空白对照组、空膜组相比差异无统计学意义，推测其原因可能是曲安奈德早期的抑炎作用利于溃疡愈合，而后期无促进局部组织增殖的作用。

BG促进溃疡愈合的作用机制明显不同于糖皮质激素。当植入体内时，生物活性材料发生特定表面反应，导致形成生物活性的碳酸羟基磷灰石层，为组织提供键合界面[10]。BG可刺激成纤维细胞分泌血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，促进皮肤微血管内皮细胞的增殖及血管网的形成[11]。在皮肤组织工程移植研究中发现，BG促进成纤维细胞、成纤维细胞的迁移能力，可在很大程度上促进创伤处血管的形成，增加胶原蛋白的生成，刺激成纤维细胞转化成为肌成纤维细胞，最终加速伤口愈合[12]。此外，BG具有一定的抑菌性，可能与其可提高局部环境pH值，使渗透压增加，以及尖锐玻璃碎片对原核细胞壁产生损伤有关[13]。BG具有良好的促进局部组织增殖的作用，本研究中BG组在第6、9天，其溃疡面积变化率与空白组、曲安奈德组相比差异有统计学意义；第12天，BG膜组面积变化率与其他3组相比差异均有统计学意义。

本实验中，空白对照组的溃疡面积有进一步增大的现象，而空膜组该现象不明显，并且第6、9、12天曲安奈德组溃疡面积变化率与空膜组接近。因此推测，由于空白膜的覆盖作用，减少了外界细菌感染与刺激，从而促进了溃疡愈合，提示研发能固定覆盖于口腔溃疡表面而不被唾液冲刷的药物基质材料，对于开发新型口腔溃疡治疗药物也有重要意义。

BG促进溃疡愈合的调控机制及作用时间点与糖皮质激素药物不同，因此在口腔溃疡的临床治疗中，可以在发病不同时期采用不同药物进行序贯治疗，如早期使用糖皮质激素类药物，后期使用BG类材料，从而进一步提高该疾病的治疗效果。此外，和传统治疗药物相比，BG的性质更加符合口腔溃疡药物的研发标准，即既能抑菌又能促进组织增生，值得进一步深入研究。