槲皮素通过抗骨相关细胞衰老作用治疗雌激素缺乏骨质疏松症的初步研究

顾艺婧， 傅稼耀， 武文婧， 吴晓恋， 吴珺华

(同济大学口腔医学院口腔修复学教研室-上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，上海 200072)

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, OPM)是最常见的原发性骨质疏松症[1]。目前临床上大多采用雌激素替代疗法或双膦酸盐类药物治疗[2]，但这些疗法存在诸多并发症[3]，如何有效安全地防治OPM，一直是国内外的研究热点。近期研究表明，骨骼退变的机制复杂，其中细胞衰老发挥着重要作用[4]。衰老细胞分泌的以促炎细胞因子为主的衰老相关分泌表型(senescence associated secrete phenotype, SASP)，会影响自身及周围正常细胞，导致组织功能障碍，从而损害器官。在骨组织中，衰老细胞分泌的SASP能促进破骨细胞形成，加重骨吸收；而靶向清除衰老细胞及SASP可有效抑制增龄性骨丢失[5]。最新研究证实，雌激素缺乏导致的骨质疏松也与细胞衰老有关[6]；且绝经或手术诱导绝经的女性在外周血中TNF-α、IL-1α等炎症因子水平显著提升，这些促炎细胞因子也被证明参与了OPM的发生[7-8]。这提示衰老细胞分泌的SASP很可能在OPM的发病中发挥重要作用。槲皮素(quercetin, Q)是抗衰老药的典型代表[9-10]，可有效清除衰老的人类内皮细胞和小鼠骨髓间充质干细胞[11]。那么，槲皮素能否通过清除衰老的骨相关细胞，抑制SASP分泌，从而防治OPM呢？为此，本研究拟建立骨相关细胞衰老体外模型及去势小鼠骨质疏松症动物模型，于体内外验证槲皮素在OPM中对骨内细胞抗衰老的作用，从而为其临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

骨细胞样细胞MLO-Y4由Lynda Bonewald博士提供。α-MEM培养基(美国HyClone公司)中添加5%胎牛血清(美国Gibco公司)、5%小牛血清(美国Gibco公司)、1%青霉素和链霉素(美国HyClone公司)，配制MLO-Y4细胞培养液。成骨细胞样细胞MC3T3-E1购自中国科学院(上海)干细胞库，α-MEM培养基中添加10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素，配制MC3T3-E1细胞培养液。在37℃，湿度95%和5% CO2培养箱中培养上述两种细胞，每3d更换1次培养基。

1.2 体外细胞衰老模型建立

对贴壁良好的MLO-Y4及MC3T3-E1细胞分别使用含200和400μmol/L过氧化氢的培养液处理2h，移除培养液，PBS缓冲液清洗，10μmol/L过氧化氢对细胞进行二次刺激并持续培养48h，建立体外压力诱导的成熟前衰老(stress-induced premature senescence, SIPS)模型。实验分为3组： 对照(control)组、氧化应激压力(OS)组和OS+槲皮素处理(OS+Q)组。给药实验中，相应浓度槲皮素(美国Sigma公司)与高浓度过氧化氢同期加入细胞培养液中，处理2h，移除培养液，洗涤细胞，再将药物与低浓度过氧化氢同时加入细胞培养液中处理细胞48h。

1.3 体外槲皮素作用浓度筛选

采用细胞增殖活性试剂盒CCK-8(日本Dojindo公司)进行细胞活力分析。在96孔板中预培养24h后，正常组细胞加入0、5、10、20、30、50μmol/L梯度浓度的槲皮素孵育48h，按照说明书，用CCK-8溶液孵育，酶标仪450nm处测量光密度(D450)。OS组细胞于高浓度过氧化氢及梯度浓度槲皮素中处理2h后，移除培养液，再将低浓度过氧化氢及同等梯度浓度槲皮素加入孔板，培养2d后，用CCK-8溶液孵育，并测量光密度。梯度浓度的槲皮素处理正常细胞及过氧化氢刺激下的细胞后，分别获得正常细胞药物毒性曲线及氧化应激后的细胞药物毒性曲线。

1.4 细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)

SA-β-gal染色(中国碧云天公司)遵循生产说明书进行。贴壁良好的MLO-Y4及MC3T3-E1细胞用PBS洗涤1次，室温固定15min，PBS再荡洗3次，每次不少于3min。加入配置好的半乳糖苷酶染色液，将细胞放置于干燥的37℃非CO2培养箱中避光过夜，次日洗涤后观察染色情况并拍照。

1.5 实验动物

7周龄雌性C57/BL6小鼠(购自上海斯莱克实验动物公司)20只，平均体质量18g，在1周的适应期后，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠(50mg/kg)。随机抽取15只，按标准方法[14]行双侧卵巢切除术(OVX)，另5只行假手术(SHAM)。术后1周，开始给药。其中，OVX小鼠再次随机分为3组： 空载体(V)组(OVX+V组)、雌激素(E2)组(OVX+E2组)和槲皮素组(OVX+Q组)。OVX+V组和SHAM+V组采用10%PEG 400作为载体，每周经口等容灌胃给药1次；雌激素组，按0.1mg/(kg·d)的剂量，每周经腹腔注射给药3次；OVX+Q组每次50mg/kg，每周经口灌胃给药1次。所有小鼠均处于标准无特异病原体级(SPF)实验室环境，在整个实验过程中，小鼠可随意获得标准饲料及水。给药12周后，称小鼠体质量。本实验已通过同济大学动物伦理审查(编号： TJLAC-018-029)，并严格按照伦理要求进行。

1.6 标本制备

术后13周，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)，分离左股骨，置于4%多聚甲醛室温下固定2d，后更换至0.5%多聚甲醛中，4℃条件下储存，用于micro-CT扫描。分离右侧股骨及胫骨用于提取RNA。

1.7 小鼠左股骨Micro-CT扫描

高分辨率显微CT(瑞士Scanco Medical AG公司，μCT50型)扫描未经脱钙的小鼠左股骨(每组3只)。在70kV，114μA，体素为14μm的条件下获取股骨图像，分析骨表面积与骨体积比值(BS/BV)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和骨小梁数量(Tb.N)等骨参数来判定骨质疏松程度。

1.8 RNA提取及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)

体内实验中，利用分离的小鼠右侧股骨和胫骨，仔细去除肌肉、软组织及骨骺，用PBS冲洗骨髓腔3次确保无骨髓残留。从富含骨细胞的骨皮质中提取小鼠骨细胞RNA。然后将骨标本置于TRIzol(日本TaKaRa公司)中溶解，并在液氮中彻底研磨，提取总RNA。体外实验中，用预冷的PBS洗涤培养的细胞3次，加入TRIzol提取细胞总RNA。提取体内或体外细胞总RNA后，通过NanoDrop ND-2100(美国Thermo Scientific公司)定量。使用Agilent 2100生物分析仪(美国Agilent Technologies公司)评估RNA完整性。RNA悬液放入-80℃冰箱长期储存，待使用时取出，于冰上解冻。使用PrimeScript®1stStrandcDNA合成试剂盒(日本TaKaRa公司)反转录mRNA，GAPDH作为内参。SYBR Green PCR master mix(瑞士Roche公司)用于qPCR扩增，加入各基因扩增引物，引物购自生物工程(上海)股份有限公司，并在LightCycler 96(瑞士Roche公司)上进行qPCR，使用LightCycler 96分析软件(瑞士Roche公司)进行数据统计，从而得出体内外细胞SIPS、SASP及成骨破骨相关基因的表达水平。p21上游引物： 5′-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3′；下游引物： 5′-CCATGAGCGCATCGCAATC-3′。p53上游引物： 5′-CTCTCCCCCGCAAAAGAAAAA-3′；下游引物： 5′-CGGAACATCTCGAAGCGTTTA-3′。IL-6上游引物： 5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′；下游引物： 5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′。TNF-α上游引物： 5′-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3′；下游引物： 5′-GCTACGACGTGGGCTACAG-3′。IL-1α上游引物： 5′-GCACCTTACACCTACCAGA-GT-3′；下游引物： 5′-AAACTTCTGCCTGACGAGC-TT-3′。TRAP上游引物： 5′-CACCCTGAGATTTGT-GGCTGT-3′；下游引物： 5′-CGGTTCTGGCGATCT-CTTTG-3′。CTSK上游引物： 5′-GAAGAAGACTC-ACCAGAAGCAG-3′；下游引物： 5′-TCCAGGTTA-TGGGCAGAGATT-3′。OCN上游引物： 5′-CTGAC-CTCACAGATCCCAAGC-3′；下游引物： 5′-TGGTC-TGATAGCTCGTCACAAG-3′。RUNX2上游引物： 5′-AACGATCTGAGATTTGTGGGC-3′；下游引物： 5′-CCTGCGTGGGATTTCTTGGTT-3′。GAPDH上游引物： 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；下游引物： 5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.9 统计学处理

实验数据用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。采用两组独立样本t检验来验证各组评价参数的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 槲皮素能有效抑制过氧化氢诱导的MLO-Y4和MC3T3-E1细胞的成熟前衰老

在槲皮素处理后，MLO-Y4和MC3T3-E1细胞的总体生存曲线均明显抬高，10μmol/L槲皮素作用于MLO-Y4细胞，20μmol/L槲皮素作用于MC3T3-E1细胞，可有效阻止细胞进入衰老或清除SASP，有利于细胞增殖，见图1。

过氧化氢处理MLO-Y4及MC3T3-E1细胞后可形成细胞衰老样变化： SA-β-gal染色阳性率增加，见图2A、B；细胞内SIPS通路的重要标志物p21、p53表达显著上升，见图2C、D；SASP表达水平显著上升，见图2E、F。在此基础上，同期加入槲皮素可有效阻断过氧化氢引发的两种细胞的衰老，并且抑制SASP表达。

图1 槲皮素对骨相关细胞的药物毒性作用Fig.1 The cytotoxic effect of quercetin on bone cellsA: 骨细胞样MLO-Y4细胞；B: 成骨细胞样MC3T3-E1细胞；Control为正常细胞的药物毒性曲线，OS为H2O2刺激氧化应激作用下的细胞药物毒性曲线

图2 槲皮素于体外抑制骨相关细胞的SIPS并清除SASPFig.2 Effects of quercetin on SIPS and SASP in bone cells in vitroA: 各组MLO-Y4细胞SA-β-gal染色；B: 各组MC3T3-E1细胞SA-β-gal染色；箭头所指为典型阳性结果；C： 实时定量PCR检测各组MLO-Y4细胞中衰老相关基因p21、p53的表达；D: 实时定量PCR检测各组MC3T3-E1细胞中p21、p53表达；E: MLO-Y4细胞中衰老相关分泌表型TNF-α、IL-6的表达；F: MC3T3-E1细胞中TNF-α、IL-1α的表达；*P<0.05，**P<0.01

2.2 槲皮素有效挽救去势小鼠骨丢失

术后13周，OVX+V组小鼠平均体质量增长值为(5.740±0.522)g，显著高于SHAM+V组的(3.180±0.097)g，差异有统计学意义(P<0.01)；而体质量变化在OVX+V组和OVX+E2组[(5.160±0.511) g]和OVX+Q组[(4.440±0.505) g]之间，差异无统计学意义(P>0.05)。

与SHAM+V组相比，OVX+V组小鼠股骨的BS/BV、Tb.Sp显著升高，Tb.N显著降低，股骨的三维图像也体现了两组间骨松质的明显差异，提示了骨质疏松的发生，证明去势小鼠的骨质疏松模型已成功建立。在体内模型成功建立的基础上，OVX+Q组小鼠股骨的BS/BV值、Tb.Sp值显著降低，Tb.N值显著升高，提示其可有效缓解OVX小鼠的骨质疏松，与传统雌激素疗法相比，差异无统计学意义。见图3。

2.3 槲皮素在体内抑制去势小鼠皮质骨内细胞衰老水平

术后13周，OVX+V组小鼠皮质骨内SIPS相关基因及SASP水平较SHAM+V组明显上调，OVX+Q组SASP表达显著降低，起到与雌激素相似的作用，见图4。

图3 槲皮素对去势小鼠骨质疏松影响Fig.3 Effects of quercetin on osteoporosis of OVX miceA: μCT分析定量小鼠股骨骨表面积和骨体积比值(BS/BV，mm-1);B: 小鼠股骨骨小梁分离度(Tb.Sp，mm);C: 小鼠股骨骨小梁数量(Tb.N，mm-1);D: 小鼠股骨头骨微结构的典型μCT图像；*P<0.05

图4 槲皮素对去势小鼠骨相关细胞SIPS及SASP影响Fig.4 Effects of quercetin on SIPS and SASP in bone cells of OVX mice in vivoA: 实时定量PCR检测各组小鼠骨皮质内SIPS相关基因的表达；B: 实时定量PCR检测各组小鼠骨皮质内SASP相关基因的表达；*P<0.05，**P<0.01

2.4 槲皮素对去势小鼠骨改建相关基因的影响

OVX+V组小鼠皮质骨内破骨、成骨相关基因表达显著升高，OVX+E2组小鼠破骨、成骨相关基因表达均显著下调。OVX+Q组小鼠皮质骨内破骨基因表达显著下调，但成骨细胞相关基因不受抑制，见图5。

图5 去势小鼠皮质骨骨改建相关基因的表达Fig.5 Expression of genes related to bone remodeling in OVX miceA: 实时定量PCR检测各组小鼠骨皮质内破骨相关基因的表达；B: 实时定量PCR检测各组小鼠骨皮质内成骨相关基因；*P<0.05，**P<0.01

3 讨 论

细胞衰老不论在老龄化骨丢失还是雌激素缺乏骨丢失中都起着重要作用[5,11]。通过抑制骨细胞衰老也可以预防雌激素缺乏骨质疏松[6]。细胞衰老主要分为复制性衰老(replicative senescence, RS)、SIPS和癌基因诱导的衰老(oncogene-induced senenscene, OIS)三种类型。目前，建立衰老细胞体外模型的方法主要是SIPS和OIS。OPM是由雌激素缺乏所引起的骨代谢失调，雌激素缺乏引发活性氧类(ROS)累积，ROS不仅在雌激素缺乏导致骨丢失的机制中起重要作用[12]，也是引发细胞DNA损伤，诱导SIPS[13]的因子之一。因此，在OPM的研究之中，ROS-SIPS较RS或OIS更适合用作细胞衰老研究的体外模型。ROS压力源的种类多种多样，包括过氧化氢处理[14]、电离辐射[15]、乙醇等。其中，过氧化氢处理是一种广为认可的细胞衰老体外模型诱导源。现阶段大多数关于过氧化氢诱导的ROS-SIPS的研究模型主要聚焦于成纤维细胞[14]、脂肪细胞等细胞，却鲜有关于骨相关细胞的体外模型。骨组织中，衰老的骨细胞分泌SASP[5]，从而影响骨组织质量，引起骨丢失。因此，本课题组选取了小鼠骨细胞样细胞MLO-Y4和成骨细胞样细胞MC3T3-E1进行研究。不同细胞株的细胞对过氧化氢的剂量反应不同。研究发现，200、400μmol/L过氧化氢分别是MLO-Y4及MC3T3-E1细胞最适宜的SIPS诱导浓度。另外，为了避免细胞只是进入短暂可逆的细胞周期阻滞，本研究对细胞进行二次低剂量过氧化氢刺激，从而使衰老水平稳定表达。本研究证实了过氧化氢能够诱导MLO-Y4和MC3T3-E1细胞产生衰老样变化，使SIPS相关基因表达上调，SASP炎症因子表达上升。

作为抗衰老药物，槲皮素能够有效清除衰老的骨髓间充质干细胞[5]，并且通过雌激素受体介导的通路促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨向分化，改善骨组织结构及功能[16-17]。由于在本研究中，槲皮素与过氧化氢同期加入细胞，可以认为槲皮素通过清除细胞环境内的SASP，阻断细胞进入SIPS状态，促进细胞增殖，从而形成细胞药物毒性曲线上的抬高，与其他研究中所述靶向清除衰老细胞的作用不完全相同。体外实验证实，槲皮素可以有效降低细胞SIPS水平，并阻断SASP释放。体内实验显示，槲皮素和雌激素都可抑制OVX小鼠皮质骨内SIPS水平，降低SASP表达，挽救OVX小鼠的骨丢失，提示细胞衰老可能在雌激素失调与骨丢失间起了关键作用，而槲皮素能缓解因雌激素缺乏导致的一系列变化。此外，破骨细胞相关基因的表达与SIPS相关基因及SASP表达趋势相似，而成骨细胞相关基因的表达略有不同，槲皮素下调SIPS、SASP及破骨水平，但不抑制成骨相关基因的表达。这提示了破骨相关基因可能首先受SASP水平的影响，被促炎细胞因子激活，相应成骨相关基因也被激活。槲皮素通过清除SASP有效地下调破骨细胞相关基因，但并不影响已被激发的成骨作用，这提示槲皮素可能有助于骨重建和预防OVX小鼠骨质疏松症。基于不抑制成骨这点，槲皮素似乎比雌激素更有优势，但还需要更多后续实验验证。

综上所述，SIPS和雌激素相关骨丢失有密切关联。早期应用槲皮素有助于抑制体外ROS-SIPS，并有效预防去势小鼠发生雌激素缺乏性骨质疏松症，抑制其骨内SASP表达，下调骨相关细胞细胞衰老水平。这表示抗衰老药不仅仅是老龄化骨质疏松症以及其他老龄性慢性疾病和功能障碍[18]的治疗新方向，也为OPM的临床治疗提供了新的视角。