肺移植术后患者细胞外组蛋白水平变化及意义

孙 梦， 江雪梅， 金 杨， 温宗梅

(1. 同济大学附属上海市肺科医院麻醉科，上海 200433； 2. 南昌大学第二附属医院麻醉科，南昌 330006)

肺移植是目前临床上治疗多种终末期肺疾病如慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、特发性肺动脉高压、特发性肺纤维化及囊性纤维化、支气管扩张等的有效方法[1-2]。随着外科手术方法的不断改进、供肺保护技术的不断进步和免疫抑制剂疗法的改善等，肺移植手术成功率逐年提高，但肺移植患者术后原发性移植肺失功(primary graft dysfunction, PGD)、感染、移植后免疫功能障碍(急性/慢性排斥反应)等并发症仍是制约肺移植患者术后生存率的关键因素[3]，其中PGD是导致患者术后早期死亡的首要原因[4]。但目前PGD发生发展的关键启动环节和调控机制尚不清楚。

细胞外组蛋白是一种新发现的内源性炎症损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMPs)分子，在严重感染时其水平显著升高，且是加重组织细胞损伤甚至引起死亡的关键介质[5]。有报道发现细胞外组蛋白在肾移植后移植物功能障碍(原发性无功能和延迟性移植物功能)肾脏灌注液中显著升高[6]，表明细胞外组蛋白在器官移植中具有重要作用。而细胞外组蛋白在肺移植中的作用未见报道，本研究旨在探究细胞外组蛋白在肺移植术后血浆中的变化水平，以及在肺移植早期并发症如PGD中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2015年至2018年同济大学附属上海市肺科医院行肺移植手术患者20例为研究对象。原发病中7例为慢性阻塞性肺疾病，5例为肺纤维化，6例为间质性肺病，1例为肺动脉高压，1例为肺淋巴管肌病。所有患者均采用静脉复合全身麻醉。手术对照组为我院15例开胸肺叶切除术的患者，健康对照组为体检的健康志愿者。

所有肺移植病例均接受同种异体肺移植术，供肺为DBD志愿捐献者。术后19例健康出院，1例术后发生PGD死亡。PGD患者由胸外科医生根据患者胸片及临床表现给予诊断。本研究符合医学伦理要求，经同济大学附属上海市肺科医院伦理委员会批准，并与患者或家属签署知情同意书。

1.2 方法

所有入选肺移植及手术对照组患者都进行采集术前(T1)、术后0h(T2)、术后24h(T3)、术后48h(T4)、术后72h(T5)及术后7d(T6)的外周血于EDTA抗凝管中，室温下3000r/min，离心10min，提取上清液于EP管中，-80℃冰箱保存。采用罗氏公司的ELISA试剂盒对血浆中细胞外组蛋白进行检测，按照说明书步骤操作： 取100μL样品加入孔内，室温孵育2h，去除孔内液体，洗板3次，加底物孵育30min后洗板3次，加显色剂孵育15min至显色充分后加入终止液，读取450nm(D450)和490nm(D490)光密度值。分析和比较血浆中细胞外组蛋白的动态变化。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 患者一般临床资料比较

共纳入20例肺移植患者，男性16例，女性4例，平均年龄(59.250±2.693)岁；纳入15例开胸肺叶切除术及15例健康志愿者作为对照组，开胸手术对照组中男性9例，女性6例，平均年龄(54.070±1.918)岁；健康对照组中男性5例，女性10例，平均年龄(50.000±2.933)岁。

2.2 肺移植术后(T2)细胞外组蛋白水平比较

与健康对照组及开胸手术对照组相比，肺移植患者术后0h血浆中细胞外组蛋白水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 对照组与肺移植患者细胞外组蛋白水平Fig.1 Comparison of plasma levels of extracellular histones between healthy control and lung transplantation patients

2.3 不同时间点肺移植患者细胞外组蛋白水平变化

与开胸手术对照组各时间点相比，肺移植组术后细胞外组蛋白水平均显著升高(P<0.01)；肺移植后细胞外组蛋白水平在术中至术后24h升高最显著，在术后0h达到峰值，差异有统计学意义(P<0.01)；24～72h呈下降趋势，但至48h 细胞外组蛋白仍显著高于术前水平，72h回降至术前水平，见图2。

图2 肺移植组及开胸手术组各时间点细胞外组蛋白水平Fig.2 The changes of extracellular histones level in lung transplantation patients and surgical controls at different time points**P<0.01

2.4 PGD患者细胞外组蛋白水平高于非PGD患者

非PGD肺移植患者细胞外组蛋白水平在术后0h升高并达到峰值，24h至术后7d呈逐渐下降趋势。PGD肺移植患者中术后细胞外组蛋白水平在术后24h达到峰值，并维持在较高水平，至PGD患者死亡时细胞外组蛋白水平仍维持较高水平，且PGD患者各时间点细胞外组蛋白水平均高于非PGD患者，见表1。

表1 PGD与非PGD肺移植患者细胞外组蛋白水平

3 讨 论

原发性移植物功能障碍是由缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)引起的一种急性肺损伤形式，是移植后早期发病率和死亡率的主要原因[4]。大量研究表明，移植手术本身是一个组织损伤过程，可直接诱发炎症反应综合征，并进一步导致细胞和组织的损伤，进而诱发PGD[7]。损伤相关分子模式分子的释放在介导先天免疫系统激活与PGD的发展中密切相关[8]，但对于PGD的启动环节及发生机制尚未阐明。

各种方式的细胞坏死导致核小体释放至细胞外即可产生细胞外组蛋白，一种新的免疫细胞死亡形式“中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)”亦能导致组蛋白的大量释放[9]。当组蛋白由胞内释放到细胞外空间成为细胞外组蛋白时可表现出新的生物学特性，如特异的抗菌能力、直接致细胞毒性和促炎特性、促血栓形成等[10-11]。研究发现，向小鼠体内注射外源性组蛋白，组蛋白可以通过TLR9-MyD88信号通路加重IRI[12]。这表明细胞外组蛋白作为损伤相关分子参与多种损伤过程，针对细胞外组蛋白作为治疗靶点的研究具有重要意义。

本研究结果显示，在肺移植手术组中，与健康对照组、开胸手术对照组以及移植术前相比，肺移植组术后血浆中细胞外组蛋白浓度显著升高，与移植术前相比呈5～7倍升高，且各时间点细胞外组蛋白水平均高于开胸手术组患者，提示肺移植围手术期有大量细胞外组蛋白被释放入血；24h开始呈下降趋势，但仍显著高于术前水平，表明细胞外组蛋白大量释放的过程为持续24h的急性反应过程；其可能与供体肺组织经过冷缺血期及供肺修复后的再灌注引起的IRI等导致中性粒细胞的大量堆积，机体受到上述创伤的应激致中性粒细胞坏死引起细胞内组蛋白向细胞外大量释放形成细胞外组蛋白有关。另一方面，移植手术本身组织损伤及术中各种创伤如外科手术，术中失血及外源性液体及血液输入等也可能导致细胞外组蛋白的升高。

PGD患者术后各时间点细胞外组蛋白水平持续在较高水平，至PGD患者死亡时细胞外组蛋白水平仍维持较高水平，表明高浓度的细胞外组蛋白在肺移植术后早期可能导致严重的早期并发症如PGD的发生，推测可能与细胞外组蛋白的毒性作用[13]、激活NLRP3[14]、损伤多糖包被途径[15]、激活血小板通路[7]及多种炎症信号通路[16]有关。PGD患者样本量少是本研究的一个缺陷，因此对于细胞外组蛋白在PGD中的具体作用机制及细胞外组蛋白对PGD的病程是否有指示作用需进一步进行深入探索。

综上所述，细胞外组蛋白在肺移植术后患者中明显升高，其可能与供肺缺血再灌注及移植手术本身组织损伤等导致损伤坏死细胞释放细胞外组蛋白有关。血浆中细胞外组蛋白可能在肺移植早期并发症PGD的病程中发挥作用，为深入探究PGD的发病机制提供了新的思路。