KCNJ15诱导钙离子内流促进T细胞分泌白介素17实验研究*

朱 琳 陈 韬 徐大琴 宁 琴

华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科 (湖北 武汉， 430033)

乙型肝炎病毒(HBV)所致的慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)起病凶险，病情进展极为迅速，是临床上最为严重、预后不良的疾病之一。目前，HBV-ACLF的发病机制仍未完全阐明，但公认为系免疫介导的肝损伤，尤其是病毒特异性细胞毒性T细胞(CTL)在HBV-ACLF发病过程中发挥重要作用[1, 2]。目前认为参与HBV-ACLF致病机制的多种因素，均直接或者间接调节T细胞免疫应答，从而导致乙型肝炎重症化[3]。我们在鼠3型肝炎病毒(MHV-3)诱导的小鼠暴发性肝炎模型中发现，病毒感染后肝脏淋巴细胞上KCNJ15表达显著增强，以CD4+T和CD8+T细胞最为显著[4]。为了进一步研究KCNJ15基因在HBV感染诱导的肝衰竭肝损伤中的作用及其机制，本研究通过体外实验，构建人KCNJ15表达质粒，利用电转染技术使Jurkat细胞过表达KCNJ15，检测Jurkat细胞的功能变化，初步探讨KCNJ15在HBV-ACLF肝损伤中的可能作用和机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 Jurkat细胞购于武汉大学细胞保藏中心(ATCC®TIB-152TM、Clone E6-1);1640培养基、胎牛血清、购自美国Gibco公司;Trizol Reagent购于上海英骏生物技术有限公司;逆转录试剂盒及BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶、T4连接酶、Ex Taq酶购于大连宝生物公司;质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购于Omega公司;SYBR Green购于TOYOBO公司;鼠抗人KCNJ15抗体购于Sigma公司;抗β-actin抗体购于Fermantas公司;电转染试剂盒(Lonza，VCA-1003)、电转仪(Nucleofector I Device)订购于武汉安特捷生物公司;检测Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit订购于BD Biosciences公司；Human Soluble Protein Master Buffer Kit及Human IL-9 Flex Set购于BD Biosciences公司;流式细胞微球芯片捕获技术(CBA)模板及其分析软件来源于BD Biosciences公司;Fluo-3AM购于Calbiochem公司；钙离子载体A23187购于Serva公司。

1.2 引物、载体和菌株 人KCNJ15扩增引物由本实验室设计，由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列如下：F:5′-TGCGGAGTGAGTGACCAG-3′，R：5′-TGTTTGAAGGGAGTTCTG-3′。pMD-18T载体、DH5α感受态细菌购于大连宝生物公司;pcDNA3.1(+)购于美国Invitrogen公司；DNA测序由华大基因公司(武汉)完成。

1.3 人KCNJ15表达质粒的构建 以NCBI中KCNJ15基因变异体1编码区序列为模板设计加入酶切位点BamHⅠ、HindⅢ的引物，扩增基因全长编码区序列。从人PBMC的cDNA 中克隆 KCNJ15基因编码区全长，经琼脂糖凝胶电泳后切胶、进行纯化。纯化后产物与 PMD-18T克隆载体连接，再转化大肠杆菌DH-5α。扩增后测序鉴定含有目的片段的样本。对测序验证正确的克隆提取质粒后行BamHⅠ、HindⅢ双酶切处理，回收并纯化，连入 pcDNA3.1(+) 表达载体。取测序正确的克隆扩大培养后提取质粒备用。

1.4 Jurkat细胞转染及分组 转染细胞前2天，按1∶5～1∶6的比例传代细胞，以保证细胞处于对数生长期。转染前，在12孔板中加入1640完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中预平衡。取Jurkat细胞，吸出细胞悬液，900 rpm离心5min后计数。分别取出1×106细胞悬液，离心、吸出上清液，将其中两管分别加入电转液(solution V 82 μl和supplementⅠ18 μl)100 μl，重悬细胞，各加入不含内毒素的pcDNA3.1(+) 2 μg和pcDNA3.1(+)-hKCNJ15质粒 2 μg，吹打混匀。分别将上述液体转入电转杯，置于电转仪上，选择程序X-05(for high expression level)行电转染。室温下静置10 min，取出预平衡的12孔板，分别取出培养基400 μl，加入到电转杯中。然后，吸出转染后的细胞至预平衡的培养基1 ml中。加入PcDNA 3.1(+)的Jurkat细胞称为对照组，加入PcDNA3.1(+)-hKCNJ15质粒的Jurkat细胞称为实验组。在空白细胞组，先用预平衡的培养基500 μl重悬，加入到另一个预平衡的培养基1 ml。将12孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，取上清液，放置于-80℃冰箱冻存用于细胞因子检测。转染后细胞用Trizol处理提取RNA或制备蛋白样本用于PCR或Western Blotting检测。

1.5 细胞因子检测 使用CBA试剂盒检测，先对标准品系列稀释。振荡Th1/Th2/Th17试剂盒内的微珠3～5 sec，取适量至空的流式管中并振荡混匀。取标准品50 μl，将稀释液加入装有微珠混合物的流式管中，吹打混匀。取转染后细胞培养上清液(实验组、对照组、空白细胞组)50 μl，加入装有微珠混合物的流式管中，吹打混匀。分别加入试剂盒内荧光素标记的检测试剂50 μl，吹打混匀。室温避光孵育3 h。清洗后，离心、弃上清液，加入清洗液300 μl，上流式细胞仪检测。将CBA检测模板导入流式细胞仪后，调节FSC、SSC、及各检测通道-参数。从试剂盒中取出setup管，按操作流程上机检测。按照模板上的提示，调整各项参数，上机检测标准管及各待测样品管，导出数据，在CBA分析软件上进行分析。

1.6 实时定量PCR检测 KCNJ15在Jurkat细胞转染质粒后48 h收集细胞，用 Trizol裂解，提取总RNA，逆转录cDNA，进行实时定量PCR检测。引物序列如下: R：5’-AGGAAGATGGCATGAGGA-3’；F：5’-ACTTAGAACCCGGTGAGC-3’。PCR反应体系为 20 μl，反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性20 s，58℃退火10 s，72℃延伸10 s，主循环35个，72℃终延伸10 min。每一个样本均设置GAPDH基因作为内参，并设置副孔。

1.7 Western blotting检测 在Jurkat细胞转染质粒后48 h收集细胞，制备蛋白样品。将实验各组蛋白样品进行凝胶电泳后，转印PVDF膜，洗膜后封闭3 h。所用一抗为小鼠抗人KCN15单克隆抗体，孵育过夜。二抗为HRP标记的兔抗鼠，室温孵育1 h。洗膜后采用化学发光系统(USA)曝光，Image Lab软件分析。

1.8 胞内钙离子浓度检测 收集转染质粒后的Jurkat细胞，重悬于loading buffer(1×106个/ml)，用Fluo-3AM(终浓度5μmol/L)染色细胞，37℃避光水浴30 min。用PBS清洗2次，再用Ca2+Estimation buffer 5 ml洗涤，以去除细胞外多余的荧光染料。随后，以Ca2+Estimation buffer 1ml重悬细胞，取200 μl细胞悬液检测静息细胞钙离子荧光强度，于流式细胞仪激发光波长488 nm通道，测平均荧光强度(MFI)，记为F。将剩余细胞以Calcium Ionophore A23187负载(终浓度10 μmol/L)，室温孵育10 min，取200 μl细胞悬液检测MFI，记为Fmax；在剩余细胞加入400 mmol/L EGTA螯合钙离子(终浓度10 mmol/L)，室温孵育20 min，检测MFI记为Fmin。胞内钙离子浓度计算公式：【Ca2+】=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)，Kd=0.4 μmol/L。

2 结果

2.1 人KCNJ15真核表达质粒转染Jurkat细胞情况 Jurkat细胞共转染pMAXGFP和pcDNA3.1(+)-hKCNJ15后48 h，在荧光显微镜下观察，显示转染效率为80%～90%。采用Real-time PCR和Western blotting技术分别检测，发现KCNJ15在基因水平实验组细胞为105.51 ± 0.58，对照组细胞为101.41 ± 1.16，两者比较，P=0.001。实验组细胞蛋白表达亦明显增强(见插页图1及图2、图3)。

图2 3组质粒转染Jurkat细胞KCNJ15基因表达图

图3 3组质粒转染Jurkat细胞KCNJ15蛋白表达图

2.2 质粒转染并培养48 h 3组细胞培养液中各种细胞因子检测结果 见表1。

表1 3组Jurkat细胞分泌细胞因子比较

2.3 质粒转染后24 h、48 h 3组细胞胞内钙离子检测结果 见表2。

表2 3组细胞两时段胞内钙离子结果比较

3 讨论

KCNJ15是内向整流钾离子通道家族(KIR)的一员，也被称为KIR4.2。KCNJ15基因编码的是一个整合膜蛋白和内向整流型钾通道，在人的肾脏、肺、胚胎纤维细胞、微血管内皮细胞以及正常小鼠肝脏均有表达[5～8]，但其功能尚未完全明确。既往文献报道，KCNJ15位于21号染色体，被认为与唐氏综合症的临床表现有关[9]。

既往研究表明，钾离子通道在T淋巴细胞的分化以及抗原介导的免疫反应中起调节作用。KCNJ15作为钾离子通道基因，可能通过调节钾离子流动、钙内流从而影响人体免疫功能。本研究团队前期研究结果显示，KCNJ15在HBV-ACLF患者外周血单个核细胞中高表达，后续研究也发现在MHV-3感染的暴发性肝炎小鼠模型中，肝脏T淋巴细胞表达KCNJ15水平显著升高，因而我们推测该分子可能通过影响T细胞的活化及功能从而参与免疫诱导的肝细胞损伤。结果显示过表达KCNJ15的Jurkat细胞分泌IL17-A的水平明显升高。

Th17细胞是具有独特免疫学功能的CD4+T细胞亚群，其主要分泌的细胞因子IL-17A在宿主对病原体感染的免疫防御反应中发挥重要作用。同时，IL-17A的异常分泌又与自身免疫性疾病、肿瘤发生均密切相关[10]。目前研究认为Th17细胞在多种肝脏疾病如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎(CHB)、酒精性肝病中发挥调节天然免疫、获得性免疫及自身免疫的作用。研究报道，乙型重型肝炎患者和急性乙型肝炎患者外周血中Th17细胞比例显著高于轻度CHB患者和健康对照人员，并且，升高的Th17细胞比例与患者血清ALT水平呈正相关[11，12]。此外，也有研究指出，Th17细胞在HBV诱导的肝硬化中也启动一系列免疫介导的病理损伤，在肝硬化致病机制中起着重要作用[13，14]。这些研究表明Th17细胞可能与乙型肝炎疾病进展和肝脏损伤的病理过程紧密相关。在本研究中我们发现KCNJ15能促进T淋巴细胞分泌IL-17从而推测KCNJ15在HBV-ACLF中发挥免疫介导肝损伤作用。而KCNJ15如何促进T细胞分泌IL-17？基于目前对于钾离子通道的认识，KCNJ15主要通过改变细胞膜电位从而影响细胞功能。另有研究报道，阻断肠道T细胞上Ca2+活化的钙通道可以抑制T细胞分泌细胞因子，包括IFN-γ、IL-2、IL-17等[15]。因此，我们推测，KCNJ15可能通过调节钙离子水平而影响T细胞的功能。于是我们检测了转染KCNJ15表达质粒后Jurkat细胞胞内钙离子浓度。结果显示，过表达KCNJ15的Jurkat细胞，胞内钙离子水平在转染后24 h显著升高。这与我们推测相符，KCNJ15可能通过调节钙离子内流从而影响T细胞分泌细胞因子如IL-17的表达水平。但这一通路的具体机制有待更加深入的研究。综上所述，本实验观察了过表达KCNJ15时Jurkat细胞分泌细胞因子及钙内流的情况，通过体外实验初步探讨了KCNJ15分子对T细胞功能的影响及机制，为后续进一步研究KCNJ15参与HBV-ACLF的免疫学机制奠定了基础。