长寿老人肠道乳酸菌的分离鉴定及其在发酵乳中的应用

董蕴，崔梦君，单春会，蔡文超，张振东，郭壮

（1.湖北文理学院食品科学技术学院，湖北襄阳441053；2.石河子大学食品学院，新疆石河子832003）

0 引 言

近年来，越来越多的研究表明膳食[3]、健康状况[3]、食用益生菌[4]和地域[5]等因素均显著影响宿主肠道菌群的构成，同时乳酸菌作为健康长寿老人肠道中的优势细菌之一，对宿主的营养代谢具有积极的作用[1-2]，因而开展长寿老人肠道源乳酸菌的分离鉴定具有一定意义。在赋予产品益生特性的同时[6]，乳酸菌发酵亦赋予了乳制品独特的风味和滋味，研究人员常采用电子鼻[7]和电子舌[8]技术对食品的风味和滋味品质进行评价，两种技术相结合更是广泛的应用于发酵乳品质的综合评价中[9]。

本研究对长寿老人粪便样品中的乳酸菌进行了分离鉴定，同时采用电子鼻和电子舌技术对其分离株制备发酵乳风味和滋味品质进行了评价，以期为后续相关产品的产业化生产提供借鉴。

1 实验

1.1 试剂及仪器设备

1.1.1 材料

脱脂牛乳粉，蔗糖。

生化试剂：MRS培养基、Luria-Bertani培养基和石蕊牛乳培养基；dNTP Mix、2×PCR mix，pMD18-T克隆载体，DNA聚合酶，溶菌酶和蛋白酶K；引物27F/1495R；AxyPrep PCR清洁试剂盒。

普通化学试剂：三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、氯仿、异戊醇、甘油、氯化钠、阴离子溶液、阳离子溶液、参比溶液、内部液和十六烷基三甲基溴化铵（hexadecy1 trimethylammonium bromide，CTAB）。

1.1.2 设备

HP-01无油真空泵，ECLIPSE Ci生物显微镜，DG250厌氧工作站，英国Don Whitley公司UVPCDS8000凝胶成像分析系统，DYCP-31D型水平式电泳槽，vetiri梯度基因扩增仪，美国AB公司；TDL-40B低速大容量离心机，PEN 3电子鼻，德国Airsense公司SA-402B电子舌，日本Insent公司LRH-150生化培养箱。

1.2 样品的采集

从襄阳市襄城区庞公雪美养老公寓和汉丹社区招募6名健康老人志愿者，其中4女2男，年龄在90～94岁之间，身体相对健康，无药物依赖史，使用行走辅助器可行走，近两周未服用药物且未接受过肠道手术。于老人用便桶内放置经紫外线照射过的食品专用袋，用无菌采样勺将样品采集于无菌离心管中，放入装有冰袋的样品采集箱中快速运回实验室进行样品处理。

1.3 乳酸菌的分离与鉴定

按照以下步骤进行乳酸菌菌株的分离和基因组提取：（1）将采集好的样品每份称取10 g后加40 mL质量浓度为0.85%的生理盐水震荡均匀，400 rpm离心10 min；（2）取上清液1 mL于石蕊牛乳中富集24 h后进行样品梯度稀释；（3）取-5和-6梯度的稀释液在含有CaCO3的MRS培养基中涂布，放置于37℃厌氧工作站（质量分数 85%N2，5%CO2及 10%H2）培养 48 h后；（4）挑选有透明圈的单个菌落在MRS培养基中纯化3代后用30%的甘油冻存于-80℃备用；（5）选取过氧化物酶阴性，革兰氏染色为阳性的菌株暂定为疑似乳酸菌杆菌；（6）采用CTAB法提取分离株的基因组DNA[10]，将提取的基因组DNA在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上跑胶检测。

按照以下步骤进行16SrDNA PCR扩增和菌株鉴定：（1）检测合格后的基因组DNA，进行PCR扩增，。扩增体系为为：正向引物27F为0.5μL，反向引物1495R为 0.5μL，10×PCR Buffer为 2.5μL，dNTP Mix为2μL，DNA聚合酶为0.2μL，DNA模板为1μL，加超纯水至25μL。；扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min 30 s，循环 30次；72℃延伸 10 min，4℃保温[11]。；（2）将PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳槽跑胶，染色15 min后在凝胶成像系统中观察；（3）将扩增的PCR产物回收清洁后进行连接、转化和鉴定，挑出阳性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序；（4）将测序所得的序列整理后在NCBI数据库中进行BLAST同源性分析比对，并应用Mega7.0软件中的邻接法（Neighbour-Joining method，NJ）构建构建系统发育树，步长值设为1000，进而判定分离菌株的分类地位。

1.4 乳酸菌分离株发酵乳的制备

菌液的制备：将制备发酵乳的菌株在MRS培养基中活化3代后，3 000 rpm离心10 min后弃上清，加入5 mL脱脂乳混匀。

发酵乳的制备：将脱脂牛乳粉、蔗糖和水（质量分数分别为11.5%，6.5%和82.0%）混合均匀，65℃水合30 min后，95℃5 min水浴杀菌并冷却至常温。按照5×106mL－1复原乳的比例接入菌液，42℃发酵24 h后4℃后熟24 h，备用。

1.5 乳酸菌分离株制备发酵乳风味和滋味品质的评价

将15 g发酵乳样品置于样品瓶中，55℃水浴10 min后冷却至室温备用。参照杨成聪的方法使用电子鼻进行发酵乳风味品质的评价[12]。

将50 g发酵乳样品加入100 mL的去离子水后，10 000 r/min离心5 min，上清液过中速滤纸抽滤后备用。参照文献[13]中方法使用电子舌进行发酵乳滋味品质的评价。

1.6 数据分析

使用曼-惠特尼（Mann-Whiney）检验对L.fermentum和L.salivarius制备发酵乳各风味和滋味指标进行显著性分析，使用主成分分析（principal component analysis，PCA）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）对L.fermentum和L.salivarius制备发酵乳品质的差异性进行评价。使用Mega7.0构建系统发育树，使用SAS9.0软件进行数据分析，使用Origin2017软件绘图。

2 结果与分析

2.1 长寿老人肠道乳酸菌的分离与鉴定

从襄阳长寿老人的肠道中总共分离出了23株疑似乳酸菌菌株，菌落的形态在质量分数为1.0%CaCO3的MRS固体培养基上呈现乳白色、表面光滑且有透明圈。菌落的直径集中在0.5～1.5 mm。菌株在革兰氏染色后均呈现为革兰氏阳性，过氧化氢实验均为阴性，菌株形态有杆状和球状两种类型。在对乳酸菌菌株进行分离的基础上，本研究进一步使用CTAB法对其DNA进行了提取，23株疑似乳酸菌基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。

图1 疑似乳酸菌基因组DNA的电泳结果

图 1中，M为 DL15000 DNA Marker；泳道1～-8为菌株HBUAS54075-菌株HBUAS54082；泳道9～16为菌株HBUAS54084-菌株HBUAS54091；泳道17～22为菌株HBUAS54099-菌株HBUAS54104；泳道23为菌株HBUAS54106。下同。

由图1可观察到各菌株在15 000 bp上方出现一条荧光条带，而条带的亮度不同则显示出了所提DNA的浓度的不同。经观察可发现所有菌株的亮度都能够满足后续PCR扩增的需要。疑似乳酸菌16Sr DNA的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。

图2 乳酸菌16SrDNA的PCR扩增产物凝胶电泳结果

由图2可观察到所有泳道均出现荧光条带，且大小均在1500 bp左右的位置，亮带并无拖尾现象。由此可见，疑似乳酸菌16S rDNA的PCR扩增较为成功，扩增产物可进行后续的研究。经清洁、连接、建克隆和测序后，本研究将23株疑似乳酸菌的16SrDNA序列进行了同源性分析，并与模式菌株一起进行了系统发育树的构建，结果如图3所示。

图3 乳酸菌16SrDNA序列系统发育树

由图3可看出：菌株HBUAS54087，HBUAS54086，HBUAS54106，HBUAS54077，HBUAS54104，HBUAS54081，HBUAS54091，HBUAS54088和HBUAS54085与模式株L.fermentum CIP102980形成了第一类群，因而鉴定为L.fermentum（发酵乳杆菌）；菌株HBUAS54099、HBUAS54100、HBUAS54102、HBUAS54103、HBUAS54076和HBUAS54090与模式菌株L.mucosae JCM 12515形成了第二类群，因而鉴定为L.mucosae（黏膜乳杆菌）；菌株HBUAS54089，HBUAS54075，HBUAS540 84，HBUAS54080，HBUAS54078和HBU AS54082与模式菌株L.salivarius ATCC11 741形成了第三类群，因而鉴定为L.salivarius(唾液乳杆菌)；菌株HBUAS54079与模式菌株L.garvieae JCM 12256形成了第四类群，因而鉴定为L.garvieae（格氏乳杆菌）；菌株HBUAS54101与模式菌株Enterococcus feacium DSM 20477形成了第五类群，因而鉴定为E.feacium（屎肠球菌）。经鉴定发现，23株乳酸菌中分别有9株鉴定为L.fermentum，6株鉴定为L.salivarius，分别占分离株总数的39.1%和26.1%。由此可见，L.fermentum和L.salivarius为襄阳地区长寿老人肠道中的优势乳酸菌类群。值得一提的是，23株乳酸菌菌株与模式菌株的序列同源性均达到了99%以上，且呈现出明显的聚类趋势，因而本研究的序列分析结果具有较高的准确性。

2.2 乳酸菌分离株制备发酵乳风味品质的评价

在对襄阳地区长寿老人肠道中乳酸菌进行分离鉴定的基础上，本研究选取可用于食品加工的L.salivarius和L.fermentum进行了发酵乳的制备，同时采用电子鼻技术对风味品质进行了评价。各传感器对两类乳酸菌菌种制备发酵乳响应值的差异性分析如表1所示。

由表1可以看出，各传感器对L.salivarius和L.fermentum制备的发酵乳响应值差异均不显著（P＞0.05），因而两类乳酸菌菌种制备的发酵乳风味无明显差异。

2.3 乳酸菌分离株制备发酵乳滋味品质的评价

本研究进一步使用电子舌对两类乳酸菌菌种制备发酵乳各滋味指标进行了评价，结果如图4所示。

图4 L.salivarius和L.fermentum制备发酵乳各滋味指标相对强度的箱型

由图4可以看出，L.salivarius制备的发酵乳涩味显著高于L.fermentum（P＜0.05），而两类乳酸菌菌种制备发酵乳样品的酸味、苦味、咸味、鲜味、后味A（涩味的回味）、后味B（苦味的回味）和丰度（鲜味的回味）差异均不显著（P＞0.05）。

2.3 PCA乳酸菌分离株制备发酵乳品质的评价

本研究在使用电子鼻和电子舌技术对15个长寿老人肠道源乳酸菌制备发酵乳风味和滋味品质进行比较分析的基础上，构建了15行×18列的矩阵，同时使用PCA对L.salivarius和L.fermentum制备的发酵乳的品质进行了评价。经PCA发现，信息主要集中在前4个主成分（principal component，PC），其累计方差贡献率为89.86%，其中，PC1的方差贡献率为41.03%，PC2的方差贡献率为25.01%。

表1 各传感器对L.salivarius和L.fermentum制备发酵乳响应值的差异性分析

图5 基于PCA L.salivarius和L.fermentum制备发酵乳品质的因子载荷

由图5可以看出，PC1主要由W1C，W3C，W5C，W6S，W2W，W2S和W1S 7个指标组成，PC2主要由酸味、涩味、咸味和丰度（鲜味的回味）4个指标组成，且W 1C，W3C和W 5C 3个对芳香物质敏感的传感器分布在X轴负方向，而酸味分布在Y轴正方向，因而在空间排布上分布于第二象限的发酵乳样品具有较佳的品质，其对应的乳酸菌菌株亦具有优良的牛乳发酵特性。因子得分如图6所示。

图6 PCA L.salivarius和L.fermentum制备发酵乳品质的因子得分

由图6可以看出，L.salivarius和L.fermentum制备的发酵乳在空间排布上呈现出明显的分离趋势，这说明两类乳酸菌菌种制备发酵乳的品质存在明显差异，经MANOVA发现，其差异非常显著（P＜0.01）。结合图5可知，分布于第二象限的发酵乳样品具有较佳的品质，因而本研究分离的L.salivarius牛乳发酵特性要优于L.fermentum。

3 结论

结果表明，L.fermentum和L.salivarius为襄阳地区长寿老人肠道中的优势乳酸菌类群。经多元方差分析发现，两类乳酸菌制备发酵乳的品质存在明显差异，结合主成分分析发现，L.salivarius制备的发酵乳整体风味品质要优于L.fermentum，因而本研究分离的L.salivarius牛乳发酵特性要优于L.fermentum。