酶联免疫法检测奶粉样本中的乳铁蛋白及其均匀度的探索

郑云鹏，赵红杰，郭靖宇，吕肖楠

（飞鹤（龙江）乳品有限公司，黑龙江龙江161100）

0 引 言

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种具有免疫功能的铁结合性糖蛋白，相对分子质量约为80 ku，具有抗菌性，抗病毒性，抗癌作用[1]。LF初乳中含量最高，另外在外分泌液（乳汁、唾液、泪液、鼻分泌物）、血浆、羊水、子宫分泌物和尿液中也含有LF[2]。

《乳铁蛋白人群健康效应专家共识》指出摄入一定量从牛乳中分离提取的乳铁蛋白，有助于改善婴幼儿营养状况，能够降低婴幼儿腹泻、新生儿坏死性小肠结肠炎、呼吸道疾病、新生儿败血症等疾病的发病风险[3]。目前，乳铁蛋白已作为食品添加剂被广泛应用于婴幼儿配方奶粉及各种功能性食品中。乳铁蛋白的检测方法有有酶联免疫吸附法、免疫扩散法、放射免疫法和高效液相色谱法[4-5]。高效液相色谱法和酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)是常用的检测方法，但其前处理繁琐，且无法除去生乳中其他杂质对于乳铁蛋白测定的干扰，免疫扩散法操作简单，能够快速检测婴儿配方奶粉中乳铁蛋白含量[6]。通过优化ELISA试剂盒样本前处理方法，并检测不同采样点的样本值，以期验证试剂盒的验证该试剂盒的准确性和稳定性，及检验奶粉样本中乳铁蛋白的均匀性，为乳铁蛋白含量检测的的相关人员提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

乳铁蛋白酶联免疫检测试剂盒（Vitest，北京纳百生物科技有限公司）；MK3酶标仪（Thermo）；分析天平（Sartorius）；移液器(RAININ 200、1000μL)；本公司批次不同奶粉样本。

1.2 方法

1.2.1 试剂盒检测原理

试剂盒基于酶联免疫原理，采用间接竞争的方法，样本吸光度值与其所含乳铁蛋白的含量成负相关，可定量检测奶粉样本中的乳铁蛋白含量。

1.2.2 ELISA试剂盒操作步骤

（1）将所需试剂从冷藏环境中取出，恢复至室温，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

（2）样品前处理：称取0.1±0.005 g奶粉样本至2 mL EP离心管中，加入1 mL 1×样本稀释液溶解，用涡旋仪涡旋至完全溶解，样本最终稀释2000倍，待检；

（3）板孔及样本编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，记录标准孔和样本孔所在的位置；

（4）加标准品/样本和抗体工作液：加入标准品/样本50 L到对应的微孔中，然后加入抗体工作液50 L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30 min；

（5）洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250 L/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10 s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干；

（6）加酶标二抗：加入酶标二抗100 L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30 min，取出重复洗板步骤5；

（7）显色：加入TMB底物液100 L/孔，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应15 min；

（8）测定：加入终止液50 L/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处测定每孔OD值，使用软件（4参数法）绘制标准曲线，并计算样品中乳铁蛋白的含量。

1.2.3 试剂盒方法的准确性验证

选取乳铁蛋白阴性样本进行添加回收实验，添加浓度分别为30，80，100，和140 mg/100g。

1.2.4 试剂盒方法的可行性性验证

选取含有乳铁蛋白的8种奶粉样本进行检测。

1.2.5 样品前处理方法优化

取4 g样本至50 mL离心管，加入40 mL去离子水稀释至10倍，再用去离子水稀释至100倍被，最后用1×样本稀释液稀释至和2000倍，待测。

1.2.6 不同采样点对检测结果的影响

选择4种奶粉样本，每种样本选择3种不同的采样点，采用优化后前处理方案，进行检测。

1.2.7 改良工艺后检测奶粉样本中乳铁蛋白的均匀度

使用改良后的工艺，混合乳铁蛋白。选择4种样本，每种样本选择3种不同的采样点，采用优化后前处理方案，进行检测

2 结果与分析

2.1 试剂盒方法的准确性验证

配置一定浓度的乳铁蛋白工作溶液添加至乳铁蛋白阴性样本中，使其终浓度为30、80、100、和140 mg/100 g。检测结果显示：标准曲线R2在0.995以上，cv在10%以内，见表1；加标样品检测值分别为34.4、74、115.6和132.6 mg/100 g，计算加标回收率分别为87.21%、108.11%、115.6%和105.58%，见表2加标回收率在87.21%-115.6%之间。此结果表明添加不同浓度的乳铁蛋白，均有较好的回收率，试剂盒准确性符合要求。

表1 标准曲线结果

表2 加标回收结果

2.2 试剂盒可行性性验证

8种不同的奶粉样检测结果显示：标准曲线R2在0.995以上，cv在10%以内，见表3；样品检测值除奶粉样1和奶粉样3外，见表4，其余均符合样品理论值（样品理论值范围为：40-86 mg/100 g）。后又对奶粉样1和奶粉样3进行复检，结果显示：标准曲线R2在0.995以上，cv在10%以内，见表5；奶粉样1和奶粉样3分别称取的平行样检测值分别为42、45.6、59.8和46.2 mg/100 g，见表6，符合样品理论值。分析这种异常值的出现可能是由于奶粉前处理方法不当，或者奶粉中的乳铁蛋白混合不均匀，造成结果与理论值有较大偏差。

表3 标准曲线结果

2.3 样品前处理优化后检测结果

使用优化后的前处理方案连续2天对16种样本进行检测，结果显示：标准曲线R2在0.995以上，cv在10%以内，见表7和表9；样品检测值全部符合品理论值，见表8和表10，未出现异常值现象。优化后的前处理方案，连续跟踪2天，18种奶粉样，均为出现异常值，说明此优化方案可行。

表4 奶粉样本检测结果

表5 标准曲线结果

表6 奶粉样本检测结果

表7 标准曲线结果

表8 奶粉样本检测结果

2.4 不同采样点对检测结果的影响

对奶粉样本27、28、29、和30分别采取3种不同的采样点采取样本，使用优化后前处理方案处理样本，检测结果如下：标准曲线R2在0.995以上，cv在10%以内，见表11；奶粉27和29检测结果符合品理论值，而奶粉样本28和30不同采样点检测结果偏差较大，见表12，其中奶粉样本28-1和30-3与样品理论值偏差较大，相对偏差达173%和171%。分析可能由于乳铁蛋白是干法混合，会造成混合不均匀，所以造成不同采样点，出现异常值。

表9 标准曲线结果

表10 样本检测结果

表11 标准曲线结果

表12 奶粉样本检测结果

2.5 改良工艺后检测奶粉样本中乳铁蛋白的均匀度

由于干混法会造成乳铁蛋白在奶粉样本中混合不均匀，所以在干混法基础上进行工艺改良。后又对对奶粉样本31、32、33、和34分别采取3种不同的采样点采取样本，使用优化后前处理方案处理样本，检测结果如下：标准曲线R2在0.995以上，cv在10%以内，见表12；4种奶粉样本检测结果均符合品理论值，见表13。

表12 标准曲线结果

表13 奶粉样本检测结果

3 讨 论

乳铁蛋白是奶粉中最重要的营养素之一[7]，选择一种快速简便准确的检测方法对乳品厂十分重要。酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)是测定乳铁蛋白含量最常用的方法之一，张英华等[8]首次在国内发表，应用酶联免疫法测定牛初乳中乳铁蛋白的含量；刘青等[9]使用ELISA法对市售的多个品牌的进口婴幼儿配方奶粉中的乳铁蛋白蛋白进行检测，发现此法有较好的适用性。本文中，选择ELISA法检测奶粉样本，发现采用未优化的前处理方案，检测结果会出现异常值，分析可能是由于前处理方法不当，造成稀释后的乳铁蛋白在样本中分布不均匀，或者是由于干法混合乳铁蛋白造成乳铁蛋白在样本中不均匀；通过优化前处理方法，连续跟踪两天实验，检测18个样本，均未出现异常值，这说明优化后的前处理方法对ELISA试剂盒有较好的适用性；3点采样法检测结果出现异常值，这就更加说明了使用干法混合会造成不同点的乳铁蛋白含量可能不同，董昊昱等[10]报道干法混合会对微量营养素混合的均匀性有一定的影响。对工艺进行改良后，分3点进行采样检测，检测结果均符合理论添加值，说明改良后的工艺，乳铁蛋白混合均匀，符合产品设计标准。

4 结论

本研究使用ELISA快速检测试剂盒检测奶粉样本中的乳铁蛋白含量，线性关系良好，试剂盒加标回收率为87.21%-115.6%之间，符合检测要求；通过优化前处理方案，保证了检测结果的稳定性；在干混法基础上，通过工艺改良，乳铁蛋白能在奶粉样本中均匀存在。