UPLC-Q-TOF/MS法测定液态乳中的糠氨酸

冯婉莹，刘结容，郑学殷，马盛龙，罗浩，区硕俊，曾广丰

（1.广州检验检测认证集团有限公司，国家加工食品质量检验中心（广东），广州511447；2.广东检验检疫技术中心，广州510623）

0 引 言

乳制品是使用牛乳或羊乳及其加工制品为主要原料，添加剂、营养强化剂或矿物质等为辅料的加工制作而成的一类食品。当牛乳或羊乳等产品经过加热灭菌后，乳中蛋白质和乳糖会发生美拉德反应，产生出糠氨酸[1]，同时加热过程中产品质量会受到影响[2-3]。糠氨酸的含量可以用于判断产品经过受热后，营养物质的损失程度，因此是作为评价液态乳质量优劣的一个重要指标[4-5]。

目前乳制品中糠氨酸的检测方法主要有液相色谱法[6-10]，液相色谱-串联质谱法[11-12]和毛细管色谱串联质谱法[13]。本文采用直接酸水解方法，同时使用超高效液相色谱，使分析时间缩短，结合高分辨飞行时间质谱，精确测定分子量，建立了测定液态乳中糠氨酸的高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF/MS）。

1 实验

1.1 仪器与设备

Triple TOF 5600+高分辨质谱仪，UPLC 20AD高效液相色谱仪，D3024R冷冻高速台式离心机，CSR-1-200超纯化水机，高真空干燥箱XFM 320。

1.2 材料与试剂

液态乳样品（保质期内测定）；盐酸、甲酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）；糠氨酸盐酸盐（纯度99.8%）。

1.3 实验条件

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取糠氨酸盐酸盐标准品各0.0500 g于100 mL棕色具塞容量瓶中，用浓度为1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，配制成质量浓度为500 mg/L的标准储备液，再用纯水稀释成质量浓度为20 mg/L的标准中间液。准确移取相应体积的标准中间液，用纯水稀释成质量浓度为10，20，50，100，200，500，1000μg/L的工作曲线。

1.3.2 样品处理

准确称取液态奶样品2 g于耐热具旋塞玻璃管中，加入质量浓度为10.8 mol/L盐酸6 mL，充入氮气保护后放至110℃烘箱24 h。待样液冷却至室温以后，转移至50 mL离心管中，再用5 mL去离子水洗涤玻璃管，并将洗涤液转移至离心管中。转速为10 000 r/min离心5 min，上清液转移至25 mL比色管中。再往50 mL离心管中加入10 mL去离子水，涡旋5min，转速为10 000 r/min离心5 min，上清液合并至25 mL比色管中，水定容摇匀后过0.22μm水相膜待上机测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex C18(100 mm×2.1 mm，2.6μm)；柱温为35℃；样品室温度20℃；进样量为5 μL；流动相A为乙腈，B为0.1%（体积分数）甲酸水溶液，采用梯度洗脱方式洗脱分离；流速为0.5 mL/min。梯度洗脱程序：0.0～2.0 min，乙腈（A）体积分数为5%；2.0～5.0 min，乙腈（A）体积分数从5%增加到60%；5.0～6.0 min，乙腈（A）体积分数为60%；6.0～6.1 min，乙腈（A）体积分数从60%减少到5%；6.1～8.0 min，乙腈（A）体积分数5%。

1.3.4 质谱条件

离子源：ESI和APCI复合源；正离子/负离子扫描方式；APCI源连接ABsciex公司自动校正系统(CDS)，每5个样品自动校正1次，APCI正离子校正液流速0.5 mL/min，气帘气（N2）：0.207 MPa，离子源雾化气（N2）：0.345 MPa，离子源加热辅助气（N2）：0.345 MPa，离子源温度为500℃，离子源电压5 000V。一级TOF-MS扫描准确质量范围为50～1 000 u；二级IDA-MS扫描准确质量范围为50～1 000 u，DP为55V，CE为（30±10）V；高灵敏模式，数据采集时间50 ms，信号阈值100 cps，IDA实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。

1.3.5 数据分析方法

所有质谱数据在ABSciex公司的Analyst TF 1.6软件采集，数据在Peak View 2.0，MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等软件上定性定量处理分析。根据TOF-MS和IDA-MS高分辨质谱获得化合物的准确分子量，定性定量分析测定液态奶中的糠氨酸质量浓度。

2 结果与分析

2.1 分析依据

采用超高效液相色谱-高分辨质谱方法检测分析液态奶中的糠氨酸，以一级母离子的精确质量数、同位素丰度比、二级碎片子离子的精确质量数作为定性依据和色谱保留时间等信息作为定性依据，母离子响应强度为定量分析依据。糠氨酸的质谱分析依据见表1，标准品提取离子流色谱图和二级质谱如图1和图2所示。

表1 糠氨酸的质谱分析结果

图1 糠氨酸标准品提取离子流色谱

图2 糠氨酸二级精确分子量质谱

2.2 样品处理条件的选择

为防止水解过程中，美拉德反应继续进行而导致糠氨酸测得值偏高，盐酸溶液的浓度一般要在6 mol/L以上。因此实验前期选取浓度为10.8 mol/L盐酸溶液进行水解，可忽略美拉德反应对实验结果的影响。同时，对水解温度和时间对糠氨酸回收率的影响进行了考察，结果发现，水解温度对回收率影响较大，当温度低于100℃时，水解时间会较长，而温度过高，有可能导致体系内沸腾，回收率也会下降。因此选取110℃为最终的反应温度，在此条件下，当水解时间延长至24 h以上时，回收率趋于稳定，日内6次平行测定平均回收率为86.0%。详细结果如图3所示。

2.4 线性关系和检出限

精确吸取相应体积的标准中间液并用纯水稀释成标准工作曲线，在优化后的色谱和质谱条件下进行测定，以X(μg/L)为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得到线性方程为Y=975.76X-4.1549，相关系数为r为0.9997，说明糠氨酸标准曲线呈现良好线性，具有准确定量的能力。分别按信噪比的3倍(S/N=3)和10倍(S/N=10)，计算检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果测定糠氨酸的方法检出限为250μg/kg，定量限为800μg/kg，表明方法具有较高的灵敏度。

图3 水解温度对回收率的影响

2.4 回收率与精密度实验

选用本底较低的生牛乳作为加标回收样品，对同一样品进行重复测定6次，取结果平均值作为样品的本底值，以本底值为基准进行3个不同水平浓度的加标回收实验，每个水平日内重复测定6次。平均回收率在84.0%～86.2%中间，相对标准偏差RSD为1.08%～4.01%。结果表明，方法的回收率高，精密度好，在日内考察中，达到日常分析测定的要求。详细结果如表2所示。

表2 生牛乳中糠氨酸的加标回收率和相对标准偏差(n=6)μg/kg

2.5 样品实际测定应用

随机抽取市面上流通的生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT杀菌乳和炼乳各20个样品，采用本方法进行测定，其中生牛乳糠氨酸质量分数范围为0.25～1.1 mg/kg，巴氏杀菌乳为0.85～2.1 mg/kg，UHT杀菌乳为12～73 mg/kg，炼乳为290～380 mg/kg。说明所测定的样品在加工杀菌等生产工艺过程中产生了一定的营养损失或使用了复原乳，对产品的品质有一定的影响。

3 结 论

本文采用盐酸溶液对液态乳进行酸水解，省去氮气吹干复溶的步骤。建立的超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱方法使糠氨酸在4 min内出峰，且峰型良好，缩短了分析时间，利用四级杆筛选后，大大减少了杂质对目标物的干扰，并且高分辨四级杆飞行时间质谱能够更加精确地确定分子量，对于目标物的定性定量分析也更为精确。方法学结果表明，该方法操作简单方便，回收率高，且选择性和灵敏度高，适用于液态乳中糠氨酸含量的实际分析测定，为液态乳中糠氨酸测定方法的研究开发提供了参考依据。