NGS技术在非梗阻性无精子症和少精子症患者Y染色体AZF区检测中的应用*

高玲霞 王 玲 蔡 杨 马旭辉 李建波 王 珺

空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心（陕西西安 710038）

Tiepolol等于1976年首次提出了在人类Y染色体长臂1区1带(Yq11)存在着精子生成基因,并将其命名为无精子因子 (azoospermia factor,AZF)[1]。1996年Vogt进一步将AZF区划分为3个区域,并命名为AZFa、AZFb和AZFc区[2]。AZF区的各亚区示意图见图1[3],AZFb和AZFc区由扩增子家族blue(b),turquoise(t),green(g),red(r),yellow(yel),gray(g)亚区组成。其中AZFa区主导精母细胞的增生，缺失多表现为唯支持细胞综合征和无精子症；AZFb区缺失病理诊断为生精过程阻滞；AZFc区缺失可造成无精子症，也可造成极度少精子症。2003年Repping等的研究证实了AZFc区部分缺失的存在,并认为其与精子生成障碍相关[4]。目前的研究发现AZFc区拷贝数变化(copy number variations,CNV)发生率最高并且种类繁多，它们和男性精液质量之间的关系说法不一[5-11]，目前AZFc区CNV与精子生成障碍之间的关系是男性不育研究中新的热点问题[12，13]，检测AZF缺失类型的方法有 3 种，液相芯片[14，15]、Real-time PCR[16]和 STS-PCR。这些方法由于检测的序列标签位点(sequence-tagged site,STS)有限，因此仅能通过STS位点缺失情况模糊推断AZF区缺失类型，不能明确缺失区域的具体范围。对于未知的缺失类型以及STS位点不完全缺失的情况会出现漏检，而且不能检测微重复。近年来，一种基于选定区域捕获结合高通量测序技术被证明在染色体拷贝数变异检测中具有传统方法所不具备的诸多优势，该技术特有的使用NGS下一代基因测序技术检测杂交的探针方式使其在染色体微小缺失诊断中尤为适合，并且可实现在单管中覆盖相比STS-PCR高出10倍的检测位点[17]。本研究首次尝试将该技术应用Y染色体AZF区的CNV检测中，研究AZFc区拷贝数的变化与男性精液质量之间的关系。

图1 AZF区示意图

资料与方法

一、材料

收集2016年7-8月在唐都医院生殖医学中心就诊的53例诊断为非梗阻性无精症或少精症为实验组 (精子浓度＜5×106/mL)，另选取219例精子数目正常的男性为对照组。所有样本经染色体核型分析，性激素检测，慢性病，睾丸恶性肿瘤和精索静脉曲张B超检测。

二、方法

（一）STS-PCR检测

外周血DNA提取采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒 (Qiagen公司，德国)，并经 Qubit 2.0 Fluorometer(Life公司，美国)测定浓度及纯度。STS-PCR检测使用深圳亚能Y染色体微缺失检测试剂盒。

（二）选定区域捕获和NGS技术检测流程

外周血DNA提取采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒(Qiagen公司，德国)。所提取的DNA用选取的152个特异性探针序列片段进行探针杂交，连接酶对杂交上的探针进行连接，经过PCR扩增后，文库就建成了。通过NGS得到这152个位点的序列计数，这些序列计数反映了原始样本AZF相应区域的DNA信息，通过这些信息可以得出Y染色体AZF区拷贝数变化情况。每批次检测均同时包含正常男性DNA质控品和空白对照。

三、统计学处理

数据统计采用SPSS19.0软件(IBM公司，美国)，X2检验分析实验结果。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、STS-PCR检测结果

实验组中检出6例AZF缺失，检出率为11.32%（6/53）。其中病例1为AZFa区完全缺失，病例2为AZFb区完全缺失，病例3,4,5为AZFc区完全缺失，病例6为AZFb+c区完全缺失。对照组中未检出STSPCR缺失型。STS-PCR方法检测的STS位点见表1，该6例STS缺失型患者PCR检测结果见图2。

表1 STS-PCR检测位点

图2 6例STS缺失型患者的电泳结果

二、NGS检测结果

对于上述STS-PCR方法检测出的6例AZF缺失患者，NGS技术检测结果与STS-PCR检测结果一致，检出率100%。NGS技术对这6例AZF缺失患者检测结果见图3。

实验组经NGS技术检出率为52.83%（28/53），对照组中NGS技术检出率为25.57%（56/219）。这其中包括了STS-PCR方法未检测出的12种异常CNV，包括AZFc区的3种部分缺失，3种重复和6种缺失伴随重复三大类。NGS技术检测出的AZF区CNV在无精子症、少精子症和正常精子数目组中的分布见表2。其中gr/gr缺失在实验组和对照组间具有统计学差异（P=0.022），AZFc区完全缺失在实验组和对照组间具有统计学差异（P=0.007）。其他CNV在实验组和对照组间没有统计学差异。

图3 6例STS缺失型患者的NGS检测结果

讨 论

一、选定区域捕获结合高通量测序技术是进行AZF区域基因重排检测的一种精确可靠技术

本次研究结果发现对于STS-PCR方法检测的六个经典位点的缺失，NGS技术检测结果与STS-PCR检测结果一致，检出率100%。对于STS-PCR方法检测出的阴性样本，NGS技术发现了STS-PCR未发现的异常，使检测异常范围更大。

目前由于STS-PCR方法采用有限的STS位点进行检测，对于未知的缺失类型或缺失区域未涉及到所用STS位点的情况，则会出现偏差和漏检，对于gr/gr等STS位点不完全缺失的情况也会出现漏检，且不能检测微重复，并且STS-PCR方法仅能通过STS位点模糊推断AZF区域缺失类型，不能明确缺失区域的具体范围、大小、涉及的基因信息。该技术的这些缺点使AZF区的CNV检测在临床上还停留在筛查的阶段，不能为临床提供准确的报告。本研究是首次利用高通量测序技术进行Y染色体AZF微缺失检测，采用了覆盖整个Y染色体AZF区及SRY、ZFY等内参基因区的寡核苷酸探针，利用探针杂交捕获的分子实验技术结合高通量测序技术，并通过生物信息分析手段，最终判定AZF区的微缺失状况。该检测技术基于探针的覆盖性好、杂交捕获的稳定性高、高通量测序及数据分析的信号值精确等优势，完美的解决了上述传统PCR技术存在的缺陷，可以极大的提高临床诊断的准确率，避免误诊引起的后续不必要的检查及治疗，对节省病人就诊花销和减少医院资源浪费有重要意义。另外，该技术由于其检测的精准性，对男性不育的临床研究也有重要的促进意义。

表2 AZF区异常类型在无精子症少精子症和正常精子数目组中的分布

二、gr/gr缺失是影响男性精子生成的一种因素

本研究发现gr/gr缺失与男性生精障碍有关。这与Bansal K[8]，Motovali-Bashi[18]，Nailwal[19]等的研究结果相一致。目前学者认为gr/gr-DAZ1/DAZ2缺失与男性生精障碍有关，gr/gr-DAZ3/DAZ4缺失与男性生精障碍无关[20，21]。这提示我们在今后的研究中对gr/gr缺失型的种类分类研究有助于探讨gr/gr缺失影响精子生成的机制。另有研究证明AZFc区基因的不同剂量是影响精子数目的一个因素[22]，gr/gr缺失，b2/b4多次重复的患者精子数目较gr/gr缺失患者少，两者具有统计学差异[23]。这提示我们在今后的研究中也应该关注AZFc区的重复类型。有研究认为gr/gr缺失会在子代中扩大缺失区域，形成AZFc区的全部缺失从而导致后代不育[24，25]。因此在行辅助生殖技术助孕前，对存在gr/gr缺失的患者进行遗传咨询，可以避免后代的遗传风险。

三、AZFc区其他的CNV与男性生精障碍的关系

b2/b3缺失是除gr/gr缺失外，AZF区CNV中占比最高的，但本次研究结果表明b2/b3缺失与男性生精障碍无关，其它的研究结果也支持该结论[9，26，27]。

本次研究中发现一例精液正常的患者b1/b3缺失，由于b1/b3缺失的发生率极低[27],其与男性生精障碍的关系有待进一步研究。

另外发现的6例gr/gr缺失，b2/b4重复也与男性生精障碍无关。KazukiSaito等[28]研究也发现在56例生精障碍中有1例存在gr/gr缺失，b2/b4重复1次的患者，65例正常精液质量组中存在两例这种CNV，两组之间也无统计学差异。ReppingS等[29]推断是由于gr/gr缺失后b2/b4重复稳定了AZFc区基因拷贝数目，因此对生精功能不造成影响；本次研究发现gr/gr重复不会导致男性生精障碍，但KazukiSaito等[28]的研究发现gr/gr重复与男性生精障碍有关。本研究还首次发现了6种AZFc区的 CNV：b2/b3倒位，g1/g3重复；b2/b3重复；b2/b3缺失，b3/b4重复；b1/b3缺失，gr/gr重复；p5/p1远端缺失，gr/gr重复；b1/b3缺失，b2/b4重复。虽然本次研究发现他们和男性生精障碍无关，但由于存在这些CNV的患者数目较少，未来仍需更进一步的研究。

综合本研究的结果，我们认为基于选定区域捕获结合高通量测序技术较STS-PCR方法有更高的检测灵敏度和分辨率，是进行AZF区基因重排分析检测的一种精确可靠技术。另外gr/gr缺失和AZFc区完全缺失与精子生成相关。目前关于AZF区CNV与男性生精障碍、睾丸表型、睾丸肿瘤等的关系的研究相对较少，随着高通量测序技术的临床化应用和其他相关研究方法的不断革新，数据的进一步积累，相信我们终将揭示他们之间的关系，更准确地指导男性不育的遗传咨询。