精子核蛋白组型转化、精液参数、精子DNA损伤与复发性流产相关性研究

张海涛 刘德风 毛加明 张 哲 杨宇卓 ，4 张洪亮 ，4赵连明 林浩成 洪 锴 姜 辉 ，4* 唐文豪 ，4*

1.北京大学第三医院泌尿外科（北京 100191）；2.北京大学第三医院男科；3.北京大学第三医院生殖医学中心；4.北京大学第三医院人类精子库

复发性流产 (recurrent spontaneous abortion，RSA)是指连续2次或2次以上的自然流产，孕12周之前多见，又称为早期复发性流产[1,2]，是妊娠期最常见的妊娠并发症，其发生率为0.8%～1.4%[3]。复发性流产的病因比较复杂，临床上即使进行了详细的病因筛查，目前也只有大约50%的病例能查明原因[4]，这些已知因素主要包括遗传、解剖学、高龄、内分泌、免疫、血栓形成、代谢及感染因素等[4-9]。

目前，针对RSA的病因研究主要集中在女性，男性因素研究较少。研究表明与RSA有明确相关的男性因素主要是染色体异常和精子DNA损伤，后者临床上可以通过检测精子DNA碎片指数（DFI）进行评估。众所周知，胚胎的遗传物质来自精子和卵母细胞，胚胎染色体异常或基因异常是导致RSA的主要原因[10,11]。此外，有些学者[12-14]认为精子DNA损伤也可能影响胚胎发育并导致流产，但关于精子DNA损伤的机制尚无统一的定论。研究表明精子核蛋白组型转换与精子DNA损伤密切相关，可能是其损伤的机制之一[15,16]，目前已成为胚胎早期流产原因研究的热点。本研究通过检测我院生殖中心64例复发性流产患者配偶的精子核蛋白组型转换，分析其与精液参数、年龄、DFI及流产次数的相关性。

资料和方法

一、研究对象

本研究选取2017年1月至2017年10月就诊于我院生殖医学中心门诊，诊断为RSA的夫妇64对，男性年龄24～52岁。排除以下双方流产因素：染色体核型(男性或女性)异常、子宫和输卵管异常、抗磷脂综合征、多囊卵巢综合征、胰岛素抵抗、甲状腺功能异常、抗米勒管激素异常等。这项研究由我院生殖中心伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

二、精液分析

禁欲2-7d手淫收集精液，完全液化后，通过计算机辅助精液分析系统 (computer-aided sperm analysis,CASA)按照 《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》（第五版）[17]规定进行精液常规分析，其中精子形态检测使用Diff-Quik方法，每张玻片至少分析200条精子，并记录形态异常的精子所占百分率。剩余精液用于精子核蛋白组型转换与DFI检测。

三、精子核蛋白组型转换

使用精子核蛋白组型转换检测试剂盒 （苯胺蓝染色法）（华康公司，深圳，中国）测定精子细胞核中组蛋白与鱼精蛋白的比值。首先把5μL制备的精液涂在载玻片上并使其干燥，再将涂片在0.2mol磷酸盐缓冲液（pH7.2）中的3%缓冲戊二醛中固定30min；然后用5%苯胺蓝水溶液与4%乙酸（pH3.5）混合5min染色，阳性染色表明组蛋白与鱼精蛋白转变异常；最后在显微镜下评估至少400个精子细胞，并计算头部染色精子的百分比。精子核蛋白组型转换异常率≤30%判定为正常。

四、精子DFI检测

使用流式细胞仪进行精子DFI的检测，至少计数5000个以上精子且重复计数2次。利用荧光络黄染料（吖啶橙）具有高度的核酸特异性染色的特性对精子DNA进行染色，染色后断裂的单链DNA精子在激光下呈红色荧光，而正常双链DNA精子呈绿色荧光。然后采用流式细胞术收集荧光信号，再采用专用的软件分析检测结果。

五、统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以X±SD表示，组间比较采用独立样本t检验；相关性分析采用Pearson法；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、精子核蛋白组型转换与年龄、精液参数、DFI及流产次数的比较

纳入的64例男性患者中，精子核蛋白组型转换正常组54例，异常组10例。核蛋白组型转换正常组与异常组比较，精子浓度、正常形态百分率与DFI有显著性差异，而年龄、精液量、前向运动精子百分比和流产次数之间无统计学差异（表1）。

二、精子核蛋白组型转换与年龄、精液参数、DFI及流产次数的相关性分析

表1 精子核蛋白组型转换与年龄、精液参数、DFI及流产次数的比较(x±s)

表2 精子核蛋白转换与年龄、精液参数、DFI及流产次数的相关性分析（n=64）

图1 精子核蛋白组型转换与DFI的相关性分析散点图

Pearson相关性分析显示，精子核蛋白组型转换异常率与精子DFI显著正相关（图1，表2），与年龄、精液量、精子浓度、前向运动精子百分比、正常形态百分率及流产次数无明显相关性（表2）。

讨 论

目前RSA病因不明，而且临床上缺乏基于循证医学证据的诊断和治疗策略，所以复发性流产是生殖医学中常见难题之一。流产的危险因素中，女方因素研究较多，而男性相关因素的研究较少，目前仅限于染色体核型分析和精子DNA损伤检测。精子是一个非常复杂和特殊的细胞，在精子发生过程中，不仅染色体数目和DNA含量发生了变化，核蛋白组型也会发生规律性的转换，即由富含赖氨酸的组蛋白逐渐转换为富含精氨酸和胱氨酸的鱼精蛋白，由于鱼精蛋白的体积仅是组蛋白的一半，所以可使精子染色质结构进一步浓缩，从而使精子遗传物质抗酸性和稳定性进一步增强。在人精子中，组蛋白与鱼精蛋白的正常转换率约为85%，剩余15%的精子染色质仍与特定区域的组蛋白结合。如果精子核蛋白组型转换异常，则会导致染色质的结构变得松散，螺旋化程度降低，从而容易受到活性氧和其他有害因素的影响，精子遗传物质受到损伤，最终影响精子的受精能力，如果损伤程度超出早期胚胎的修复能力就会影响胚胎早期发育甚至导致流产[15,16,18-21]。另一方面，鱼精蛋白还能抑制DNA转录及基因表达，使精子遗传物质保持稳定[13]。因此精子内核蛋白组型转换是评价精子成熟度的重要指标，与精子DNA损伤关系密

切[21]。

多项研究结果表明，人类精子核蛋白组型转换异常与精子发生障碍及DNA损伤密切相关，同时可能影响精卵结合，精子核蛋白组型转换异常率是目前预测受精率最有意义的评价指标[22,23]。我们研究结果表明RSA患者中，精子核蛋白组型转换异常组精子浓度、正常形态百分率明显低于正常组，DFI则明显高于正常组。叶飞等[24]研究认为核蛋白组型转换异常率≤30%组精子正常形态百分率明显高于异常率≥60%组，而DNA损伤则显著低于后者，但与30%＜异常率＜60%组相比均无统计学差异，其研究结果与我们的结果不完全一致，原因可能是前者研究分成核蛋白组型转换异常率≤30%组、30%～60%组和≥30%三组，而我们的研究只分为两组。同时相关性分析结果显示反复流产夫妇男性精子核蛋白转换异常率与精子DFI显著正相关。国内外多项研究也发现精子组蛋白转换异常或者鱼精蛋白缺乏的患者精子DFI明显升高[14,24-29]，与我们的研究结果基本一致。多数研究使用了不同的技术进行精子核蛋白组型转换的检测，例如变性条件下的苯胺蓝、甲苯胺蓝、色霉素A3和吖啶橙等方法进行研究，无论使用何种技术，都得出了相同的结果。因此，核蛋白组型转换异常可能是精子DNA损伤的原因之一，可进一步影响精子的受精能力及早期胚胎质量甚至导致流产。

综上所述，我们研究发现RSA患者配偶精子中核蛋白组型转换正常组和异常组在精子浓度、正常形态百分率以及DFI存在显著差异，同时核蛋白组型转换异常率与精子DFI显著正相关，其异常可能是精子DNA损伤的原因之一，可作为临床评估RSA男性因素的一项可靠指标。但本研究入组患者例数较少，尚需要扩大样本量来进行深入研究。