非连续密度梯度离心法不同离心力对精子DNA完整性的影响*

谭秀飞 张洪麟 廉征宇 孙德印 李 末

大连医科大学附属大连市妇产医院，大连市妇幼保健院生殖中心（辽宁大连 116000）

近年来，随着辅助生殖技术的发展，越来越多的不孕不育症患者有了生育的希望，据统计男方因素导致的不孕不育约占总体的40%～50%，但传统的精液分析并不能充分解释男性生育力相关问题，因此有部分学者提出需要更多的参数来弥补传统精液分析的不足，其中精子DNA完整性的定量分析得到了多专家的认可，已有研究指出精子DNA碎片化指数 （DNA fragmentation index，DFI）与临床妊娠率、活产率等呈负相关性[1]，同时有人指出精子DFI易受到外界因素及自身疾病、生活习惯等的干扰，特别是精液的优化处理作为辅助生殖技术中必不可缺的一环，目前学界对DFI的影响尚缺乏统一的意见[2,3]。

针对不育症患者精液优化处理的研究已成为临床研究工作的重点之一，最新发布的《WHO人类精液检查与处理实验室手册》[4]中精液优化处理方法包括了简单洗涤法、非连续密度梯度离心法以及直接上游法，其中非连续密度梯度离心法因其回收率高结果稳定，操作更易标准化，被更广泛的应用于目前的临床IVF、ICSI中，离心力作为梯度离心最重要的参数，对DFI的影响尚不十分明确。本次研究的目的是通过对比不同离心力下的传统精液参数以及DFI，明确离心力与DFI、精液参数之间的关系，得到最适合临床工作的离心参数。

资料与方法

一、研究对象

搜集2016年6月至2017年6月在大连医科大学附属大连市妇产医院生殖中心接受人工授精治疗的100例不育症男性患者精液样本，所有患者均符合以下条件：（1）精液体积≥4mL；（2）根据 WHO 第 5版标准精液分析为正常；（3）不育症考虑女性因素所致，排除不明原因不育及明确的男方因素；（4）排除梅毒、艾滋病、丙肝、淋病、尖锐湿疣等传染性疾病。所有患者均签署知情同意书，研究经大连医科大学附属大连市妇产医院伦理委员会同意。

二、仪器与试剂

精液分析使用清华同方精子分析仪CASAS-QHIII；巴氏染色液购自深圳华康生物医学工程有限公司；精子DNA碎片检测试剂盒购自深圳博锐德生物科技有限公司；梯度离心培养液使用Origio公司的Pure-CeptionTM梯度离心培养液（40%、80%）；精子培养液使用Origio公司的Quinn'sTM精子培养液。

三、方法

（一）样本采集

100例患者采集前禁欲2～7d，手淫法采集精液样本于无菌无毒的广口容器内，室温下摇匀器充分混匀液化后，由经过国家男性健康重点实验室培训的2名实验员按照WHO第5版标准分别进行检测，严格质控。

（二）分组

100例样本充分混匀，取4mL均分为4份，1mL作为空白对照组，其余3mL参考WHO最新推荐精液优化处理，分别使用 300×g、400×g、500×g进行非连续密度梯度离心，作为3个处理组 （为300×g组、400×g组、500×g组）。

（三）非连续密度梯度离心

在离心管中制备密度梯度液，下层为1mL 80%PureCeption梯度离心培养液、上层为1mL 40%Pure-Ception梯度离心培养液，静置待出现清晰分离界面，将液化的精液充分混匀，取1mL液化精液覆盖于上层培养液液面上方， 以 300×g、400×g、500×g离心 20min 后弃上清液，5mL精子培养液重悬精子沉淀团，轻轻吹打然后以200×g离心5min，弃上清液，共洗涤两次，用0.5mL培养液重悬精子沉淀团后进行检测。

（四）精液常规分析

标准依据 《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第5版，使用计算机辅助精液分析系统(computer aided sperm analysis，CASA)进行分析，包括精液PH、精子总数、浓度、活动率（PR+NP）、前向运动精子百分率（PR）。

（五）形态学分析

标准依据 《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第5版，使用巴氏染色法染色，每张玻片读取至少200个精子，统计正常形态率。

（六）DNA完整性检测

染色质扩散法 （sperm chromatin dispersion,SCD）采用精子DNA碎片检测试剂盒（深圳博锐德生物科技有限公司），将精液与琼脂糖混合固定于载玻片，溶解细胞去除核蛋白，染色剂染色，最后用显微镜观察结果。根据精子DNA产生的光晕进行评估，正常的精子DNA产生扩散的光晕，而损伤的精子DNA则不产生或产生很小的光晕，结果判断标准：（1）大光晕：单侧光晕厚度大于精子头部最小直径；（2）中光晕：介于大光晕和小光晕之间；（3）小光晕：单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1/3；（4）精子头部仅产生较少的光晕或者无光晕，小光晕和无光晕精子为存在DNA碎片的精子，计数至少400个精子。精子DFI=［（小光晕精子数+无光晕的精子数+退化的精子数）/400］×100%。

（七）统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据的统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，处理前后各组精液浓度、活动率、形态以及DNA碎片率等数据比较采用t检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

100名志愿者的精液样本基本参数见表1。

由表2可见，3个处理组在精子浓度方面均较对照组有有所下降，在活力方面均较对照组有明显提高，而在前向运动精子百分率、精子正常形态率方面比较差异无统计学意义（P＞0.05），另外，以上几方面在3个处理组间进行对比差异均无统计学意义。300×g和400×g组的精子DFI均明显低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），而本次实验的500×g组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，比较前向运动精子回收率在3个处理组之间差异并无统计学意义。

表1 100名志愿者精液基本参数

表2 不同处理方案后精液质量比较（x±s）

讨 论

精子的DNA可分为两个部分，即位于头部的精子核DNA以及位于精子中部的线粒体DNA（mDNA），其本质都是一种被鱼精蛋白紧密包裹着的高度折叠结构，几乎包含了父系传递给子代的所有遗传物质，其结构的完整性直接影响到受精卵的形成甚至子代的生长发育，另一方面，精子DNA的完整性易受到多种因素影响，其中包括过氧化损伤、鱼精蛋白的缺失或突变、热损伤以及生殖腺毒性物质损伤等[3]，因此如何在处理过程中获得更多DNA完整的精子已逐渐成为国内外生殖中心的研究热点。

关于精子DNA完整性的检测方法目前国内外的标准尚不完全统一，根据检测的原理不同大致可分为直接法和间接法，其中直接法主要应用探针对目标DNA进行直接检测，间接法则是利用断裂DNA的理化特性通过检测中间产物进而判断DNA的完整程度，目前临床上最常见的检测方法有原位末端标记试验（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）、精子染色质结构分析试验（sperm chromatin structure assay，SCSA）、染色质扩散试验（sperm chromatin dispersion，SCD）等。 本次研究我们选择了SCD法，相关的临床资料已证实SCD法对精子DNA的完整性有较好的预测价值，与其它检测手段的结果存在一致性[5]，并且较其它检测方法SCD法检测技术更成熟，操作更便捷有利于临床应用。

本次研究中离心力300×g与400×g组的精子DFI经过梯度离心处理后均较对照组有明显改善，这与郑毅春等[6]的研究结果一致，证实了梯度离心处理在优化传统精液参数的同时能够改善精子DNA的完整性，这一切可能得益于双层梯度离心培养液对精子的悬浮以及缓冲作用，也有可能是由于优化处理过程中去除了精浆中对精子有害的炎症因子，但仍有部分学者对此持否定的意见，张清健等[7]既往研究对比了离心力300×g与1200×g对精液的浓度、活力、形态、DFI等方面的影响，结果发现无统计学差异，Stevanato等[8]经过研究后认为离心对精子DNA完整性的改变并不是单向的，甚至有部分参数比处理前更差，这与本实验中离心力500×g组相似，处理后离心力500×g组DFI明显高于其它处理组，我们认为可能是由于梯度离心过程中额外产生的氧化活性物质（reactive oxygen species，ROS）包括超氧阴离子、过氧化氢、氢氧基、过氧羟自由基等引起了DNA的损伤，也有人认为离心过程中较高离心力产生的横向剪切力破坏了精子的正常结构从而导致了DNA的损伤，这可能需要未来我们搜集更多的资料来探讨。

本实验中包括前向运动百分比以及精子存活率在内的传统精液参数均在处理后较对照组有所提高，这与邓顺美等[9]的结论一致，他们通过离心处理临床弱精子症的样本统计后得出结论认为非连续密度梯度法制备精子能显著提高弱精子症患者精子总活力、前向运动精子百分率、正常形态精子百分比和精子DNA完整性，符合我们的预期，但本次研究中正常形态精子百分比在处理前后并未表现出明显差异，甚至在500×g组较处理前有降低的趋势，这可能是由于较高离心力引起了精子形态学的改变，关于是否影响精子的受精潜能可能需要未来做进一步的研究。

尽管国内外已有许多研究报道在辅助生殖技术过程中精子DNA的完整性与临床成胚率、着床率、活产率以及不良妊娠率等均有密切关系[1,12-14]，最新的欧美泌尿外科以及生殖医学学会指南中都已经将精子DNA完整性列为男性不育的检测指标之一[10,11]，但是关于精子DNA完整性对妊娠的影响目前国际上尚存争议，学者Zidijrah等[12]研究后发现在复发性流产的夫妻中男性精子的DFI比正常夫妻明显升高，说明精子DFI可能是复发性流产的相关因素之一，冯娜等[13]则通过统计IVF患者的妊娠结局发现高DFI可以明显降低辅助生殖技术的临床妊娠率及活产率，这与国外Jin等[1]的研究结论类似。但是仍有很多学者持不同观点，近期Zhang等[14]总结了既往20个大型研究得出结论认为精子DNA完整性对于辅助生殖技术的指导意义目前仍不能明确，需要更多的数据来佐证。

综上所述，离心力在非连续密度梯度法制备精子过程中发挥着重要作用，适当的离心力能够有效的优化精液，但过高的离心力可能会对精子造成不可逆的损伤，因此临床辅助生殖工作过程中我们应尽量避免高离心力对精子的损害，采用适当的离心力不仅能富集精子提高精子活力，还能得到更多DNA完整的精子，有效降低了精子DFI，为后续实施人类辅助生殖技术保驾护航。