苯酚硫酸法测定苗药艾纳香中多糖含量

张倩茹 凌 蕾 何芋岐 秦 琳 杜艺玫 杨梦婷 姜 媛 谭道鹏

遵义医科大学药学院，贵州 遵义 563099

艾纳香(BlumeabalsamiferaDC.) 又名大风艾、冰片艾，苗药名档窝凯，为菊科多年生草本植物，广泛分布于广西、贵州、云南、广东等省[1]。具有祛风除湿，温中止泻，活血解毒的功效，作为苗药常用于治疗风寒感冒、头风痛、风湿痹痛、寒湿泻痢、跌扑伤痛等症[2]。艾纳香除作为民族药直接用于临床外，还是天然冰片——艾片(左旋龙脑)的主要提取原料[3]。化学成分研究发现，艾纳香含有挥发油类、黄酮类、倍半萜类、酚酸类等多种成分[4-8]。多糖是生物体中广泛存在的物质，现今植物多糖研究日益受到关注，许多植物多糖被发现具有很好的生物活性，如香菇多糖能够抗肿瘤[9-10]，人参多糖[11-12]能提高免疫力等。目前对艾纳香中的多糖类成分研究较少，刘刚等[13]通过蒽酮-硫酸法及3,5-二硝基水杨酸(DNS)法对艾纳香中的糖类成分含量进行了测定。本实验采用对多糖含量测定应用更广泛的苯酚-硫酸法对艾纳香中多糖含量进行测定，以期为今后艾纳香药材全面化学成分研究及系统质量评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 紫外-可见分光光度计(岛津UV-2401PC)，DK-S24 型电热恒温水浴锅( 上海森信实验仪器有限公司)；DZF-6030A 型真空干燥箱 ( 上海恒科学仪器有限公司)；BT125D 电子天平( 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；葡萄糖对照品(购自中国食品药品检定研究院，批号0892-200716)；其它试剂，苯酚(分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号20140122)；硫酸(分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司，批号20140101)，水为蒸馏水。

1.2 样品来源 艾纳香药材购自贵州苗药生物科技有限公司，经作者鉴定为菊科植物艾纳香Blumeabalsamifera(L.) DC. 的干燥叶及嫩枝。

2 方法与结果

2.1 测定波长的选择 分别取葡萄糖对照品溶液、供试品溶液和水各1.0 mL于量瓶中，各加5%苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，摇匀，置沸水浴中加热显色30 min，迅速冷却至室温，定容，混匀，在紫外-可见分光光度计中进行波长扫描，结果显示对照品溶液和供试品溶液在490 nm处均有最大吸收，并参考文献[8]，确定本实验的最佳测定波长为490 nm。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品25 mg，置50 mL量瓶中加水溶解，定容，摇匀，即得。

2.3 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.5、 1.0、 2.5、 3.0、 4.0、 5.0 mL，分别置25 mL量瓶中，加水定容，摇匀，即得浓度为0.01、0.02、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列标准溶液；分别吸取上述系列标准溶液和水1.0 mL置10 mL具塞试管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，摇匀，置沸水浴中加热30 min后取出，迅速冷却至室温，于490 nm处测定吸光度值。以葡萄糖标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y= 7.1971x+ 0.0174，R2= 0.9967。结果表明，葡萄糖在0.011～0.108 mg/mL范围内具有良好的线性关系(见图1)。

2.4 供试品中多糖含量测定 取艾纳香药材粉末0.50 g，精密称定，加乙醚100 mL，加热回流 0.5 h，放冷，弃去乙醚溶液，残渣置通风橱内挥尽乙醚后，加水 200 mL，加热回流 2.0 h，趁热过滤，用少量热水洗涤滤器，合并滤液与洗液，放冷，定容至250 mL，过滤，精密量取续滤液1 mL，置具塞试管中，加水 1.0 mL，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入 5% 苯酚溶液 1.0 mL”起，依次测定吸光度，并依标准曲线方程计算出供试品溶液中葡萄糖的量，进一步根据供试品制备过程计算得到艾纳香供试品药材中多糖的含量。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取1份艾纳香药材 (批次：20171003)，按照本文“2.3”的方法操作，连续测定吸光度6次，记录吸光度A值分别为：0.4292、0.4287、0.4290、0.4101、0.4009、0.4296，RSD值为2.98% ，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取精密度试验用溶液，分别放置0、10、20、30、40、50、60 min测定吸光度，记录吸光度A值分别为：0.4292、0.4208、0.4103、0.4201、0.4109、0.4277、0.4265，RSD值为1.83%，表明样品溶液在60 min内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取6份艾纳香药材 (批次：20171003)，按照“2.3”的方法平行操作，分别测定吸光度，记录吸光度A值，并计算多糖的含量分别为：2.97%、3.15%、3.01%、3.10%、2.91%、3.02%，平均含量为3.03%，RSD值为2.87%，结果表明试验重复性良好。

2.5.4 回收率试验 精密称定已知含量(3.03%)的艾纳香药材 (批次：20171003) 6份，每份约0.25g，分别精密加入约7.5 mg/mL的葡萄糖标准品溶液1 mL后，水浴蒸干，按照本文“2.3”的方法平行操作，分别测定吸光度，记录吸光度A值，并计算加样回收率，结果表明本实验方法回收率较好，见表1。

表1 样品加样回收率试验结果

2.6 样品测定 按“2.4”项下方法制备不同批次供试品溶液，测定其吸光度，并计算其多糖的含量，结果如表2所示。

表2 不同批次艾纳香中的多糖含量

3 讨论

多糖含量的测定方法主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸(DNS)法等，其中苯酚-硫酸法及蒽酮-硫酸法的原理是将多糖水解并脱水后与苯酚或蒽酮反应成有色化合物，于最大吸收波长处测吸光度；而DNS法的原理是3,5-二硝基水杨酸与还原糖反应生成棕红色的氨基化合物，因此可以直接测定还原糖，或者经水解后测定总糖含量。刘刚等[15]通过蒽酮-硫酸法及3,5-二硝基水杨酸(DNS)法对艾纳香中的糖类成分含量进行了测定，结果显示艾纳香中的总糖含量为：14.32%～43.28%，还原糖含量为：2.73%～7.75%，多糖含量为：9.61%～34.22%，远远高于本文采用苯酚-硫酸法测定的结果2.19%～3.11%。可能与药材的产地、采收时间等影响因素有关，也可能是测定方法的原因。苯酚-硫酸法基本不受蛋白质的影响，且产生的有色化合物较为稳定；蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有碳水化合物，但色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定干扰，且稳定性较差；DNS法中显色剂易与色素等还原性物质显色，干扰测定结果，并且水解时间要求控制严格。紫外分光光度法测定药材中某一类成分易受到其它成分的干扰，准确性易受到影响。然而，对于多糖类成分由于缺少紫外吸收，无法采用高效液相法测定，因此，仍广泛采用显色法利用紫外分光光度计测定其含量。因此，在选择多糖的含量测定方法时宜尽量对药材中的化学成分类型全面研究，针对其化学成分组成选择对多糖含量影响较小的测定方法。

目前多糖的提取工艺主要有热水浸提法、加热回流法、超声提取法、微波提取法、酶提法等，本文参考《中国药典》中药材多糖含量的测定方法，并对加水量、回流时间、及显色加热时间等进行了考察，并优选出最佳的提取及显色条件。

多糖类成分在自然界中分布广泛，大部分多糖都具有多种生物活性。艾纳香是贵州大力发展的道地苗药，主要用于冰片的提取，已有文献报道艾纳香还含有黄酮类、倍半萜类等多种化学成分，但很少有对艾纳香中多糖类成分的报道。本文以葡萄糖为对照品，建立了苯酚-硫酸法测定艾纳香中多糖含量的测定方法，为艾纳香药材资源的综合利用提供一定的参考依据。