HPLC法对不同产地骨碎补习用品柚皮苷的含量测定

1.昆药集团股份有限公司药物研究院，云南 昆明 650100；2.云南大学教育部自然资源药物化学重点实验室，云南 昆明 650091

柚皮苷的化学结构式

骨碎补是水龙骨科植物槲蕨Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根茎，为我国常用中药。其可疗伤止痛、补肾强骨，外用亦可消风祛斑；临床上主要用于跌扑损伤、筋骨折伤、肾虚腰痛、筋骨痿软、耳鸣耳聋、牙齿松动等，外治斑秃和白癜风等[1]。 除2015年版《中国药典》收载的骨碎补外，历代文献中记载的骨碎补习用品有来源于3个科6个属的10余种药用植物[2]。目前从骨碎补中分离所得的化学成分主要涉及黄酮、三萜、酚酸及其的苷类等[3]，现行的药典规定用高效液相色谱法测定其中主要成分柚皮苷的含量以控制其质量[1]。本课题通过对比不同文献与药典记载的提取方法及实验结果，选用微波提取法和具有创新性的实验型闪式提取器在不同实验条件下对同一种类骨碎补进行有效成分的提取，并对提取效率进行对比；同时对五种不同品种的骨碎补通过提取器经相同条件提取其中有效成分，进行柚皮苷含量大小的比较，旨在为骨碎补药材的开发与利用提供科学依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 LC-Agilent 1100型高效液相色谱仪；中草药粉碎机(FW135)；实验型闪式提取器(JHBE-50V)；ME204E/02电子天平；KQ-5200B超声仪；XH-100A微波催化合成/萃取仪；甲醇为色谱纯(Fisher)，乙腈为色谱纯(Fisher)，甲酸为分析纯，水为二次重蒸水。

1.2 材料 柚皮苷标准品购自成都普菲德生物技术有限公司(纯度≥98%)；骨碎补药材由云南中医药大学提供，药材均由云南中医药大学民族医药学院尹子丽老师鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性试验[1-2]以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)；流速：0.9 mL/min；温度：室温；检测波长：283 nm，理论板数按柚皮苷峰计算应不低于3000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取柚皮苷标准品6.3 mg，用甲醇溶解并于100 mL量瓶中定容，制成63.0 μg/mL的柚皮苷溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 微波法[4]选取一种骨碎补样品(鳞轴小膜盖)，用粉碎机粉碎3次，每次10 s。称取药材粗粉约0.50 g，精密称定，置于三口烧瓶中。根据文献和实际操作，加入甲醇∶水=2∶1的甲醇水溶液150 mL，微波协助提取70 ℃，保温8 min(每分钟暂停搅拌一下以保证有效成分充分溶解)，取出，冷却至室温，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液。

2.3.2 提取器提取法一 将骨碎补习用品用粉碎机粉碎3次，每次10 s。称取药材粗粉约10.00 g，精密称定，于小烧杯中待用，精密加入分析纯甲醇(≥99.8%)2 L于提取桶，倒入先前已精密称定的药材粗粉，开启提取器提取2 min，用注射器取下层清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液。

2.3.3 提取器提取法二 将骨碎补习用品用粉碎机粉碎3次，每次10 s。取其中一种药材(鳞轴小膜盖)的粗粉约10.00 g，精密称定，于小烧杯中待用，精密加入甲醇1400 mL和蒸馏水700 mL于提取桶，搅拌使两者混合均匀，再倒入先前备用的药材粗粉，开启机器提取2 min，用注射器取下层清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液。

比较方法2.3.2和2.3.3的提取效率大小，择优对其他品种药材进行提取。

2.4 线性关系考察 精密吸取柚皮苷对照品溶液2.5、3.5、5.0、7.5、10.0 μL依次进样，测定峰面积。以柚皮苷质量为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)进行线性回归得回归方程为：y=1.6505×109x+62.03，R2=0.9958。结果表明柚皮苷进样量在157.5～472.5ng范围内有良好的线性关系。

2.5 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液(鳞轴小膜盖)10 μL，在2.1色谱条件下进行测定，测得柚皮苷峰面积RSD0.08%(n=3)，表明精密度良好。

2.6 稳定性实验 精密吸取同一对照品溶液5 μL，分别间隔0、18、24h，在2.1色谱条件下进行测定，测得柚皮苷峰面积RSD1.00%，表明柚皮苷在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性实验 对同一批骨碎补药材(鳞轴小膜盖)，按2.3.3供试品溶液的制备方法平行制备3份，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，按2.1色谱条件进行测定并计算柚皮苷含量，RSD1.31%(n=3)，表明此法重复性良好。

2.8 样品含量测定 取不同种类的骨碎补的样品，按2.3确定的方法分别依法制备，分别精密吸取供试品各10 μL，注入液相色谱仪，测定柚皮苷的含量。结果表明所测定的5种样品中，柚皮苷的含量差异较大，且两种提取方法的提取效率不同。见表1和表2。

表1 同一骨碎补样品(鳞轴小膜盖)用不同方法提取柚皮苷的含量 (n=3)

(注：提取器提取法1中溶剂是纯甲醇；提取器提取法2中溶剂是甲醇水溶液(甲醇∶水=2∶1)。两者其他条件均相同。)

表2 不同品种骨碎补样品柚皮苷的含量

3 讨论与结论

实验采用高效液相色谱法测定不同来源的骨碎补药材中有效成分柚皮苷的含量大小，对五个不同品种的骨碎补用新型的方法进行测定，并选择其中一个品种改变方法和溶剂作为对照。测定结果表明：不同产地不同品种的柚皮苷含量差异较大，同一提取方法和操作步骤所得的鳞轴小膜盖中柚皮苷的含量最高为0.0618 μg/g，中华槲蕨、石莲姜槲蕨和团叶槲蕨中不含有柚皮苷；同种提取方法采用不同的溶剂提取也对测定结果有影响，即用提取器提取时，对于同一药材的样品，纯甲醇作为溶剂时提得的柚皮苷含量比以66.7%的甲醇水作为溶剂提取得的柚皮苷含量高近一倍；不同的提取方式对于柚皮苷的提取效率亦有影响，根据方婧等人[4]的实验结果和结论进行些许调整所采用的微波法提取测得的柚皮苷含量比用新式的实验型闪式提取器提取同一批药材所测得的柚皮苷含量高了一个数量级，为0.5663 μg/g，但该含量相较于其他文献所记载的[2,4-6]仍较低。

2015年版《中国药典》对骨碎补的含量测定项中规定[1]按干燥品计算，含柚皮苷(C27H32O14)不得少于0.50%。按规定，本实验所测定的不同种类的骨碎补中柚皮苷含量均不合格，分析原因可能如下：实验创新性地采用实验型闪式提取器进行药材有效成分柚皮苷的分离提取，该方法目前无文献记载，故均按照其说明书上所写每次每种药材均提取2 min。通过对比测定所得的数据计算得的结果推测，药材中的有效成分柚皮苷可能并没有被完全提取出，由此导致最终测定得的柚皮苷含量较低，之后在该方面的实验可改变提取器对药材粉末进行提取的时间和溶剂组成进行研究。对中药材的粉碎度大小对其中有效成分的浸出提取率亦可能有相当影响，该方面也可作为一个研究方向进行后续的深入探究。此外，配置对照品溶液时是用小烧杯先精密称量再进行定容，但小烧杯和样品的质量差异较大故产生的误差也可能较大，从而影响标准曲线中峰面积相对应的浓度的大小，进而对测定结果产生影响。

按文献记载的微波法[4]提取所得的柚皮苷含量经计算得的结果比文献所记载的结果小了4个数量级，可能是受多方面因素影响的结果。文献记载实验中考察溶剂对提取效率的影响时发现50%甲醇的提取率最高，而本实验中的溶剂是66.7%的甲醇；文献考察提取温度对柚皮苷提取效率的影响时发现120℃时提取率最高，而甲醇的沸点只有64.7℃，故本实验实际操作时设置的微波温度为70℃，可能会对提取结果产生影响；在保温时间方面，文献中得出的结论是柚皮苷在保留5 min后即已提取完全，故选定保留时间为5 min，而本实验因为设定的提取温度比文献中使用的低，故相应的延长对药材粗粉的保温时间至8 min，实验操作者猜测该项对柚皮苷提取率的影响应较小。此外，不同种类和产地的骨碎补本身所含的柚皮苷含量可能本身就差异很大且质量参差，如中华槲蕨、石莲姜槲蕨等甚至不含柚皮苷。同一来源品种药材的干燥程度、取药部位、药材本身的质量也可能对测定结果产生影响。

在用实验2.1项下的色谱条件前，先采用了现行的2015版药典中规定的用于骨碎补含量测定的色谱条件下的流动相，即甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)[1]，但结果十分不理想。进行色谱条件的稳定性和重复性实验时，连续进标样测得的保留时间由14.56 min逐渐延长至14.67 min，且24h后甚至延长至17.39 min，远比大多数文献[2,4,5]所写的时间要久。此外，该流动相对于柚皮苷的响应值较小，进样量达10 μL时峰高也只有23.4，比文献记载[4,6]的小了近一个数量级；而所出标准峰的对称因子较大，进样量仅7.5 μL时就已经高达2.43；检测来源于同一份提取液的第二三份供试品试液时甚至仅在3 min左右出现了一个杂峰，此外再无其他峰。按经验推测，该结果可能与流动相的酸性偏大及检测时间较长已经对液相柱造成一定压力和损害有关。经商讨最终决定更换流动相成分再进行含量测定。

按前期的实验操作[2]中的色谱条件更换流动相为乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)后，测定结果大大改观，峰面积的响应值与其他文献记录的相符，保留时间也相近，即在8 min左右出标准峰，且每次所出峰的对称因子均小于1，色谱的稳定性与重复性也较好。故本实验最终采用乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)作为液相色谱的流动相。

由实验结果可知，实验型闪式提取器对骨碎补的提取率低于微波提取，可见该种方法还不能被广泛应用于对中药材标准的含量测定，设定的提取时间、温度和溶剂都还有改进提升效率的空间，这需要做进一步的实验进行探究。此外，实验虽未完全按照药典规定的方法对骨碎补进行含量测定，但结果仍具有一定的参考价值。首先，药典中的各检测方法虽为国家规定的具有法律强制效力的标准，也有其不太合理的地方，比如本实验中的流动相按药典规定的比例配制，所得到的实验结果十分不理想，当然也可能与仪器性能跟不上有关。其次，药典规定的提取方法操作较复杂，且提取时间过久，不利于质检所进行实操；且有效成分的提取率受多方面影响，不能保证检测时有效成分已完全提取出，质量标准控制的实行仍存在一定问题。