金感胶囊微生物限度检查方法适用性研究

滕 钰 徐 洪 周映佑 罗 曼 薛咏兰 黄 婕 王 俊

贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004

药品微生物控制是药品安全性保障的重要措施[1]。药品一旦受到微生物污染，将造成药品变质、成分分解失效甚至产生毒素，引起疾病、威胁生命[2]。微生物限度检查不仅能正确地反映药品企业生产工艺及处方比例的合理性及科学性，也是保证药品质量的重要手段[3]。

金感胶囊为独家生产品种，处方组成为金银花、穿心莲、板蓝根、蒲公英、对乙酰氨基酚、盐酸金刚烷胺、马来酸氯苯那敏，具有清热解毒，疏风解表的功效[4]。目前还未见相应微生物限度检查方法的报道。本文按《中国药典》要求，依照品种特性，建立了适宜的微生物检查方法，以补充该品种的在微生物质量控制方面的空缺。

1 仪器与材料

1.1 仪器 1300生物安全柜(赛默飞世尔)；ME2002电子天平(梅特勒-托利多)；KB240低温培养箱(BINDER)；BF240恒温培养箱(BINDER)；DK-98-ⅡA水浴锅(天津泰斯特)。

1.2 样品 金感胶囊(批号：20161104、20161116、20170619，贵州百灵企业集团制药股份有限公司)。

1.3 菌种 黑曲霉(CMCC(F)98003)、白色念珠菌(CMCC(F)98001)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)、枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)、大肠埃希菌(CMCC(B)44102)等均购自中国食品药品检定研究院。

1.4 培养基 麦康凯琼脂培养基(批号：1604055)、胰酪大豆胨琼脂培养基TSA(批号：18042762)、沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA(批号：18010864)、沙氏葡萄糖液体培养基SDB(批号：18073161)等购自北京陆桥技术股份有限公司；胰酪大豆胨液体培养基TSB(批号：18030915)、麦康凯液体培养基(批号：20180828)等购自北京三药科技开发公司。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 取“1.3”项下菌种，按2015年版《中国药典》四部通则1105、1106“菌液制备”项下进行[5]。

2.2 供试液制备 称取批号为20161104的样品10 g，加入TSB至100 mL，40℃水浴保温混匀，即得1∶10供试液。取3份稀释倍数为1∶10供试液(10 mL)，分别加入TSB至50 mL、80 mL、100 mL，即得1∶50、1∶80、1∶100稀释倍数供试液。

2.3 预试验

2.3.1 计数方法[5]试验组：取1∶10、1∶50、1∶80、1∶100供试液，分别加入“2.1”项下制备的黑曲霉、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌，混合，使得每mL供试液中对应菌浓度不大于100 cfu。分别取1 mL上述黑曲霉、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌与供试液混合液平行注皿，倾注20 mL TSA，33 ℃培养3 d计数；分别取1 mL上述黑曲霉、白色念珠菌与供试液混合液平行注皿，倾注20 mL SDA，23 ℃培养5 d计数。供试液对照组：不加菌液，其余按“试验组”制备菌液组：不加供试液，其余按“试验组”进行。回收比值=(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液对照组，其范围应为0.5～2。

2.3.2 计数方法预试验结果 按“2.3.1”操作所得结果如表1所示，表明该品种对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌有抑制作用。其中抑制白色念珠菌的生长较明显：当供试液稀释倍数为1：50时，白色念珠菌在TSA和SDA培养基上的回收比值均小于0.5，不符合《中国药典》规定；当需氧菌、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验环节的供试液稀释倍数分别为1∶100、1∶80时，白色念珠菌的回收比值为0.73、0.91，能够达到药典要求，故选择上述稀释倍数进行正式试验。

表1 金感胶囊计数方法预试验结果

2.3.3 控制菌检查方法[5]取10 mL 1∶10供试液，分别接种至100 mL、150 mL、200 mL TSB中，加入不大于100 cfu的大肠埃希菌，混匀，33 ℃培养18 h。取1 mL培养物至100 mL麦康凯液体中，43 ℃培养24 h后划线接种于麦康凯琼脂平板上，33 ℃培养18 h，以上即为试验组。同法制备阳性对照组，对比观察菌落形态。

2.3.4 控制菌检查方法预试验结果 由表2可知，方法适用性试验的所有体积均能检出相应阳性菌，故选择TSB 100 mL作为正式试验TSB培养基体积。

表2 金感胶囊控制菌检查预试验结果

注：“+”表示有典型菌落生长

2.4 正式试验

2.4.1 计数方法 需氧菌、霉菌和酵母总数计数分别采用1∶100供试液、1∶80供试液，按“2.3”项下操作进行。由表3可知，回收比值均大于0.5，符合药典规定。

2.4.2 控制菌检查[5]以TSB培养基体积 100 mL，按“2.3.3”项下操作，即得试验组和阳性对照组。另取10 mL 1∶10供试液，接种至100 m TSB中，混匀，33 ℃培养24 h。取1 mL培养物至100 mL麦康凯液体中，43 ℃培养48 h后划线接种于麦康凯琼脂平板上，33 ℃培养72 h，即得供试品对照组。培养结束后，试验组和阳性对照组均检出大肠埃希菌，供试品对照组未检出大肠埃希菌。

表3 金感胶囊计数方法适用性试验结果

3 讨论

研究中，霉菌和酵母菌计数时供试液稀释倍数小于需氧菌总数计数的，但其对应的白色念珠菌回收比值高于需氧菌计数环节，且差别较大。除去培养温度、培养时间的原因外，可能还与培养基差别有关。资料显示，沙氏葡萄糖琼脂培养基中葡萄糖含量高、pH值5.6左右，有利于霉菌和酵母菌的检出[6]。经测，本研究所涉及的胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基灭菌后pH值分别为7.29、5.57，与解慧等[7]的研究数据接近。而白色念珠菌最适生长pH为5.0左右[8]，因此沙氏葡萄糖琼脂培养基的pH值更适合白色念珠菌生长。

另外，沙氏葡萄糖琼脂培养基的氮源是动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物，胰酪大豆胨琼脂培养基中氮源为胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物。两者氮源类别的区别在于前者配方中是动物性蛋白质来源水解物，后者则为植物性蛋白质来源水解物；植物性蛋白质如大豆的水解物往往会缺少某些微生物必需的氨基酸[9]。这可能是白色念珠菌在胰酪大豆胨琼脂上回收比值更低的原因。

微生物限度检查方法直接影响检验结果及药品评价的准确性[10]。建立微生物限度检查方法时，要考虑药品所含成分的抑菌性[11]。金感胶囊的特殊之处在于其处方中既有中药成分，也有西药成分。品种成分中，除了有金银花会抑制白色念珠菌的明确报道外[12]，马来酸氯苯那敏成分可能会降低白色念珠菌的回收比值[13]，此外未见关于其它组分抑菌性的报道；但本研究发现样品会对枯草芽孢杆菌的生长产生抑制，并不能明确是何种组分造成的影响，因此可对其它组分的抑菌性进行进一步研究。