胸腺肽α1联合肺泡灌洗对铜绿假单胞菌定植的支气管扩张患者免疫失衡及临床疗效的影响*

梁秋亭， 温泳涛， 柳元斌， 赵一菊， 谢衬梨

东莞市第五人民医院呼吸内科 (广东东莞 523900)

支气管扩张，主要是指支气管及其周边肺组织产生炎症反应和纤维化等现象，损伤支气管壁肌肉与弹性组织结构完整性，进而造成支气管结构形体发生改变，增加呼吸障碍、肺源性心脏病等严重并发症发生率[1]。有研究指出，支气管扩张患者主要特征是受损的下呼吸道反复感染或持续的细菌定植[2]。而铜绿假单胞菌是支气管扩张症患者最常见的定植菌之一，该菌不仅极易产生多重耐药，且不易被呼吸道防御系统彻底清除，其导致患者病情恶化，生活质量下降及病死率升高[3-4]。另有研究还发现支气管扩张症可能与免疫失衡有关[5]。因此，本研究拟采用随机对照的临床试验设计方法，针对铜绿假单胞菌定植的支气管扩张患者，临床方法多样，本文主要研究胸腺肽α1联合肺泡灌洗疗法的应用效果，观察其疗效及对患者机体免疫功能产生的影响效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2016年6月至2018年9月，选择在我院住院后病情好转稳定的119例铜绿假单胞菌定植的支气管扩张患者，在征得患者同意并签署书面知情同意书后进入本次研究。其中有3例患者因故退出本研究，其中1例因大咯血行手术治疗退出本研究，2例患者因呼吸衰竭退出本研究。实际完成研究例数116例，随机分为观察组与对照组，分别纳入59、57例，两组患者基本资料对比，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

项目例数年龄(岁)性别[例(%)]吸烟[例(%)]肺功能男女有无FEV1(L)FVC(L)观察组5957.7±6.828(47.5)31(52.5)36(60.0)23(40.0)1.47±0.51.87±0.8对照组5757.1±8.128(49.1)29(50.9)35(61.4)22(38.6)1.43±0.61.90±0.6P值0.6670.8580.9660.6970.820

注：FEV1:第1秒用力呼气容积；FVC:用力肺活量

1.2 患者入选标准及排除标准 入选标准：(1)有长期咳嗽、咳脓痰的支气管扩张症病史；(2)胸部HRCT证实存在支气管扩张；(3) 患者病情稳定后连续2次痰培养铜绿假单胞菌阳性；(4)肝、肾功能正常。排除标准：(1)有其他进行性基础疾病或严重并发症的患者；(2)妊娠妇女；(3)胸腺肽过敏者。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 所有患者安全度过急性期，病情相对稳定后，连续2次痰培养仍存在铜绿假单胞菌，以自愿原则，随机分为两组进行维持治疗。对照组行单纯肺泡灌洗，肺泡灌洗方法：局麻2%利多卡因，雾化吸入或喷洒咽喉部；整个过程中系严格监护患者生命体征，包括心电图、呼吸节律、血气分析等，予低流量吸氧，纤维支气管镜经鼻或经口腔套管进入，吸除气道内分泌物后，予使用一次性注射器抽取37 ℃无菌生理盐水20 mL,由吸引孔缓慢向支气管内推注,注意避免引起患者出现呛咳情况,负压吸引回收灌洗液，反复多次冲洗,至抽出液体清亮为止,灌洗液总量为50～100 mL 左右。操作其间若动脉血氧饱和度(SaO2)降低到80%以下时抽出管镜，置入鼻导管进行吸氧(高浓度)或行无创机械通气，等到SaO2上升到90%以上后再予以灌洗疗法。每2周1次，疗程3个月。观察组皮下注射胸腺肽α1，1.6 mg/支,每周2次，共3个月(意大利Patheon公司，国家药品批准文号H20080079)+肺泡灌洗。

1.3.2 标本采集 分别在第 0、3个月收集患者静脉血 5 mL×2管。其中一管采用肝素抗凝，用以检测 T 淋巴细胞亚群；另一管不抗凝，分离血清用以检测炎症因子。

1.3.3 检测方法

1.3.3.1 外周血淋巴细胞Th17细胞检测 对照管和样本检测管中加入肝素钠抗凝血，100 μL 1640培养基和4 μL BD GolgiPlug(刺激剂和蛋白转运抑制剂)，培养箱孵育4 h。加入抗体CD3+、CD8+，避光孵育15 min。随后加入BD intrasure固定液A避光孵育5 min，再加入红细胞裂解孵育10 min，离心弃上清；加固定液B，在对照管中加入抗体IgG1-PE，样本管中加入抗体白细胞介素(IL)-17，避光孵育15 min，离心洗涤，重悬，CD3+CD8-反设门圈取CD4+Th细胞，检测CD3+CD8-IL-17+细胞。

1.3.3.2 外周血淋巴细胞Treg细胞检测 对照管中加入抗体CD45+、CD4+、IgG1-APC、IgG1-PE，样本检测管中加入抗体CD45+、CD4+、CD25+、CD127+，两管中再分别加入50 μL肝素钠抗凝血，避光孵育15 min；随后加入2 mL红细胞裂解液，反应15 min后离心，弃上清液，再离心洗涤1次，重悬，检测CD4+CD25+CD127low的表达。

1.3.3.3 血清炎症因子检测 采用ELISA技术检测血清炎症介质IL-6、转化生长因子-β(TGF-β)和IL-17、IL-10的检测(试剂盒购于美国Ray Biotech公司,按实验操作步骤)：制备好标准曲线，分别在孔板中加入标准曲线和血清样本各100 μL，摇床孵育2.5 h；洗板，加入抗体，孵育1 h，洗板，拍干，加入100 μL酶，孵育45 min，再洗板拍干，每孔加入底物孵育30 min后加入终止液，立刻在酶标仪(Thermo公司)上，以450 nm波长检测吸光度，绘制标准曲线，计算样本的OD值。

1.4 疗效观察

1.4.1 临床症状 以记录患者治疗前后咳嗽症状改善与咳痰量为主：(1)咳痰量：无咳痰记为0分，轻度记为1分，24 h痰量≤50 mL；中度记为2分，24 h痰量51～100 mL；重度记为3分，24h痰量>100 mL。(2)咳嗽：无咳嗽记为0分；轻度记为1分，每天咳嗽频次<10，不干扰工作，夜间咳嗽症状消除；中度记为2分，频次10～20，干扰正常工作活动，伴夜间咳嗽；重度记为3分，频次>20，对工作产生严重影响，夜间无法入睡。将患者对应的评分相加即为临床症状评分。

1.4.2 再次感染次数 对比观察组和对照组患者6个月内呼吸道再感染次数。结合O′Donnell等[6]的标准研究期间急性加重发生情况：患者伴有以下≥4个症状：(1)排痰量或痰液颜色发生改变；(2)呼吸困难症状严重化；(3)咳嗽程度、次数等增加；(4)持续高热；(5)喘息症状严重；(6)自感周身不适或运动量明显降低；(7)肺部功能减退；(8)胸X线、CT检查结果提示肺部病灶有进展；(9)肺部听诊音出现变化。

1.4.3 肺功能测定 治疗前后均要检测患者肺功能[1秒用力呼气容积(FEV1)、FVC及呼气峰流速(PEF)]，以上操纵均由专业人员进行，选用仪器为Vmax 229型肺功能仪，以上每个指标均需连续进行3次，将最优值设为检测结果。

1.4.4 免疫指标测定 测定两组病例第 0、 3、6个月免疫因子Treg、Th17的水平，Th17/Treg比值，炎症因子IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β水平。

1.5 统计学方法 用Excel.2007表格与SPSS 20.0统计软件分别统计与处理实验数据，符合正态分布的分别用独立样本t与2检验，否则用LAD-t检验。经计算，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胸腺肽α1联合肺泡灌洗治疗铜绿假单胞菌定植的支气管扩张患者的免疫指标的影响 治疗前两组患者Th17细胞、Treg细胞和Th17/Treg比例差异均无统计学意义(P>0.05)。而对照组仅给予肺泡灌洗治疗后，上述免疫指标无明显变化。然而，观察组患者治疗后Treg的活动值明显高于治疗前，差异有统计学意义 (P<0.001), Th17的比例和Th17/ Treg比例均明显低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.001)。此外，治疗后与对照组相比，观察组Th17细胞和Th17/Treg比例水平降低，差异有统计学意义(P<0.001)；Treg细胞水平增加，差异有统计学意义(P<0.001)。见表2。

免疫指标例数Th17TregTh17/Treg观察组59 治疗前2.46±0.935.12±1.040.47±0.19 治疗后0.54±0.33*△7.42±1.41*△0.076±0.032*△对照组57 治疗前2.48±0.895.09 ±1.170.49±0.22 治疗后2.63±0.945.08 ±1.310.52±0.25

*与同组治疗前比较P<0.001；△与对照组治疗后比较P<0.001

2.2 两组炎性细胞因子比较 观察组和对照组在治疗前，IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β的表达水平之间差异无统计学意义(P>0.05)。此外，对照组治疗前、后IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后观察组的IL-17和IL-6显著降低，差异有统计学意义(P<0.001)，IL- 10和TGF-β显著升高，差异有统计学意义(P<0.001)。此外, 与对照组治疗后比较，观察组IL-17和IL-6水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.001)；IL-10和TGF-β水平则明显升高，差异有统计学意义(P<0.001)。见表3。

2.3 两组临床症状及再次感染情况及肺功能比较 观察组和对照组治疗前的临床症状和再次感染次数差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后，观察组咳嗽、咳痰症状，肺功能及再次感染明显减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组仅临床症状及肺功能明显改善，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后观察组患者的临床症状评分和再次感染次数明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后观察组及对照组患者的肺功能均改善，观察组患者的肺功能FEV1改善更多(P<0.05)。见表4。

组别例数IL-17(pg/mL)IL-6(pg/mL)IL-10(pg/mL) TGF-β(pg/mL)观察组59 治疗前8.32±1.614.24±1.220.86±0.2292.4±11.8 治疗后6.20±0.74*△3.21±1.50*△1.23±1.51*△110.4±9.73*△对照组57 治疗前8.53±2.114.12±1.310.84±0.3591.7±9.69 治疗后8.61±1.874.43±1.420.92±0.4492.6±10.5

*与同组治疗前比较P<0.001；△与对照组治疗后比较P<0.001

项目例数临床症状(分)再次感染次数(次)FEV1(L)FVC(L)观察组59 治疗前5.3±0.43.7±0.51.47±0.51.87±0.8 治疗后3.6±0.5*△2.4±0.7*△1.95±0.3*△2.13±0.4*对照组57 治疗前5.2±0.73.8±0.81.43±0.61.90±0.6 治疗后4.0±0.8*3.7±0.91.66±0.7*2.02±0.5*

*与同组治疗前比较P<0.05；△与对照组治疗后比较P<0.05

2.4 不良反应 观察组1例出现关节疼痛，所有患者均完成治疗。对照组没有特别的主诉。

3 讨论

支气管扩张是>3 mm的近侧支气管，管壁肌肉和弹性组织结构完整性发生破损而出现异常扩张的情况，数次感染后造成以上结构损伤严重，对管壁的支撑功能显著降低，支气管壁破坏又导致纤毛功能明显下降，引发分泌物阻塞管腔,导致引流不畅而加重感染[7]。研究报道铜绿假单胞菌是其常见的定植菌，该菌可在机体免疫力低下时大量增殖引起支气管扩张急性发作,造成严重感染并产生多重耐药。该菌可以生物膜为“屏障”实现对抗菌药物作用过程与宿主细胞免疫系统的有效抵制，进而以慢性定植菌的身份居留在支气管扩张患者气道内；并能够生成Ⅲ型分泌系统、脂多糖等毒力因子，袭击宿主细胞，促使肺部感染症状严重化,同时造成多重耐药[8]。感染及环境污染等因素刺激时,病原菌所含的某些抗原成分或代谢产物可激发局部肺泡巨噬细胞的生物活性，进而促使其快速合成并释放炎症因子，以白细胞介素等为主，白细胞介素又作用于肺泡巨噬细胞与支气管上皮细胞形成炎症因子，炎症因子可激发巨噬细胞活性形成基质金属蛋白酶，促进血管内皮细胞表达相关炎症因子，促进炎症反应、血管生成与组织纤维化等进程，进而损伤支气管组织以及黏膜纤毛运动正常功能等，以上过程还会降低黏膜对细菌清除能力明显降低，进而促进病原菌的定植过程，反复感染[9]。早先研究已证实支气管扩张的发病机制可能与 T 淋巴细胞部分功能的缺损有关,反复感染及细菌定植导致患者免疫失衡[10]。已有研究表明，铜绿假单胞菌患者病情严重程度更高，炎症状态相关性更强，临床、肺功能及影像学特征恶化，生活质量及远期预后较差[11]。

支气管肺泡灌洗是当前广泛应用的一种治疗支气管扩张的方案, 其原理是利用灌注生理盐水清洗呼吸道分泌物，降低气道压力，提高气道通畅程度。已有研究显示，支气管肺泡灌洗治疗支气管扩张合并感染的优点在于支气管镜可直达病变部位，清除分泌物彻底；灌洗刺激可诱发咳嗽，有利于痰液及炎性物质的排出, 促进病灶吸收；提高患者的肺通气功能以及血氧含量。其可通过对患者支气管进行数次灌洗与吸引，促进支气管管腔中痰液、痰栓引流过程，收获良好的应用效果[12]。

伴随微创技术的改良与发展，临床用纤维支气管镜对病灶进行直接治疗的病例不断增多，该疗法能明显提升用药效率。针对支气管疾病患者能有效吸除痰液，提升病程漫长者病源的有效清除率，为后期临床治疗做铺垫。在本次研究中，实施纤维支气管镜肺泡灌疗法，能直接清洗病灶，提升淤积痰液清洗率，减轻临床症状，提高肺功能，提升整体治疗效果。本研究结果显示，两组治疗总有效率比较，差异有统计学意义。观察组咳嗽咳痰、再次感染次数、肺功能差异有统计学意义(P<0.05)。胸腺肽为一类提升晶体免疫力药物，在疾病临床治疗中有较广泛应用，其由胸腺上皮细胞分泌，同时进入机体循环参与T淋巴细胞分化成熟进程，此外，该类药物还可激发细胞免疫活性，进而更明显的提升病患免疫功能[13]。在本研究中发现, 观察组治疗前后比较，胸腺肽α1联合肺泡灌洗治疗可使Treg明显升高，Th17 和Th17/Treg比值明显下降，而对照组无明显改变。观察组治疗前、后比较，IL-17和IL-6明显下降，IL-10和TGF-β显著增加。对照组则无明显变化。再次感染的数量而言,观察组治疗前后再次感染显著降低，而对照组治疗后没有明显变化。观察组的平均次数低于对照组。

总之，肺泡灌洗疗法有助于减轻支气管扩张患者临床症状，增强肺部功能。支气管扩张张患者胸腺肽α1联合肺泡灌洗,可以显著减少咳嗽和痰的症状,改善肺功能，可以减少再次感染的数量,提高患者的免疫系统功能。不良反应小，是支气管扩张的一种新的预防治疗方法。