UPLC-MS/MS法同时测定动物油脂中11种喹诺酮类兽药残留

董昕/品测（上海）检测科技有限公司

0 引言

喹诺酮类药物（fluoroquinolones,FQs）是一种人工合成的广谱抗菌药。因其具有性质稳定、价格便宜、抗菌谱广、抗菌活性强等优点，常作为饲料添加剂来预防和治疗动物疾病[1]。但FQs会在动物体内产生残留，严重危害人体健康。欧盟、美国、日本等国相继制定了喹诺酮类在动物组织中的最高残留限量。2002年中国农业部235号公告规定了牛、羊脂肪中的达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星的MRLs值为100 μg/kg。2016年中国农业农村部2292号公告中禁止在动物食品中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星[2]。禽畜产品中喹诺酮类药物的残留情况作为继瘦肉精之后的又一个重点予以监控，建立高效可靠的喹诺酮残留检测的方法势在必行。

喹诺酮类药物的检测方法有微生物检测法、免疫法（酶联免疫法和免疫亲和色谱法）、光谱法、高效液相色谱及液质联用技术等[3]。这些方法针对的基质主要是动物肌肉组织。喹诺酮类药物经过食物链富集作用主要积聚于动物的肌肉和脂肪，而针对动物油脂中喹诺酮类药物的检测，相关的国家标准方法和文献都较少。本实验以11种喹诺酮药物为研究对象，建立了动物油脂中喹诺酮类药物残留的检测方法，为动物油脂类产品中兽药残留的监测提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及材料

液相色谱-串联质谱仪（Waters公司，H-CLASS型液相，配AB公司API-5500 Triple Quad型串联质谱检测器）；ME204型分析天平(瑞士梅特勒公司托利多)；超纯水系统 (美国Millipore公司)；高速冷冻离心机(湖南湘仪公司)；Talboys旋涡振荡器(美国Talboys公司)、超声仪（上海安谱公司）。

正己烷（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、丙酮（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、净化柱（PRIME HLB柱）：6 mL、200 mg或相当者（沃特世公司）。色谱柱 ：BEH C18 2.1×50 mm，1.7 μm（沃特世公司）。

11种喹诺酮类兽药标准物质（氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、恶喹酸、沙拉沙星），纯度≥98%，由上海安谱实验科技有限公司提供。市售猪油。

1.2 样品提取

称取1.0 g试样于离心管中，加入5 mL正己烷涡旋溶解，加入10 mL 80%乙腈水（0.1%甲酸）溶液涡旋5 min，常温超声10 min，4 000 r/min冷冻 （4℃）离心5 min，取下层乙腈水层上样PRIME HLB小柱，滤出液过0.22 μm滤膜后供LC-MS/MS检测。

1.3 标准溶液的配置及标准工作曲线

标准储备液：分别准确称取11种喹诺酮类兽药 10 mg（精确到 0.1 mg），至 10 mL 棕色容量瓶中用甲醇定容至分度，得到各喹诺酮类标准储备液（1 000 μg/mL）。于 -20 ℃以下避光储存，使用期限不超过6个月。

标准工作液：分别量取适量的喹诺酮标准储备液，用20%乙腈水稀释制备成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL 的系列标准工作液。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：BEH C18，2.1 mm×50 mm，1.7 μm；流动相：A乙腈 B 0.1%甲酸+2 mmol/L甲酸铵水；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；色谱柱温度：30 ℃；洗脱梯度 ：0 min（10%A） 0.5 min（10%A） 1.5 min（30%A）3.0 min（90%A）4.0 min（90%A）4.01 min（10%A） 5.0 min（10%A）。

1.5 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描模式：MRM；扫描时间窗口设置：0～5 min；气帘气：30 psi；碰撞气：Medium；离子化电压：5 500 V；离子源温度：600 ℃；喷雾气：50 psi；辅助加热气：60 psi；母离子，子离子及去簇电压，碰撞能量保留时间见表1。

2 实验结果

2.1 标准曲线的绘制

根据每种化合物的响应强弱，配制不同浓度的系列标准溶液。以各化合物峰面积(Y)对其浓度(X，μg/L)绘制标准曲线，结果表明每个化合物在各自的浓度范围内具有良好的线性关系，其相关系数r均不低于0.99（表2）。

表1 液相色谱串联质谱11种喹诺酮类兽药母离子，子离子及去簇电压，碰撞能量

以空白油脂样为样品，加入喹诺酮类标准物质，按照1.2方法进行处理，依照不同倍数稀释，通过LC-MS/MS检测，以定量离子信噪比（S/N）≥10为界限，确定其最低检出限，以称样量1.0 g计，得最低检出限为 1.0 μg/kg。

表2 液相色谱-串联质谱法11种喹诺酮标准曲线

2.2 结果计算

X=CV/m

式中：X——试样中各喹诺酮类药物含量，μg/kg；

m——样品质量，g；

V——样品定容体积，mL；

C——测定用样液中各喹诺酮类药物浓度，ng/mL

2.3 回收率及重现性实验

以猪油为样品，加入标准溶液，加标量值分别为1倍检出限、2倍检出限、10倍检出限进行6平行试验，按照1.2方法分别进行处理，通过LCMS/MS 分析（结果见表 3）。加标量 1.0 μg/kg，各喹诺酮类药物平均回收率88.2%～97.9%，精密度1.23%～5.69%；加标量 2.0 μg/kg，各喹诺酮类药物平均回收率87.5%～96.5%，精密度1.83%～3.37%；加标量10.0 μg/kg，各喹诺酮类药物平均回收率88.8%～93.6%，精密度1.52%～5.18%；符合回收率在80%～110%之间，精密度≤10%要求。

表3 猪油试样PRIME HLB柱回收率添加实验结果

3 结果讨论

3.1 提取和净化

针对动物油脂的特点，其主要成分是脂肪酸，易溶于非极性溶剂，比较石油醚，环己烷，正己烷，发现油脂在正己烷中溶解最佳，因此本实验选择正己烷为溶剂。溶解油脂样品后采用乙腈、酸化乙腈、酸化乙腈水分别提取。酸化乙腈相较于乙腈，提取效果更优；对于使用PRIME HLB柱，发现在乙腈水比例为8∶2时（0.1%甲酸）提取效率和对PRIME HLB柱的通过率均最佳，因此选取80%乙腈水（0.1%甲酸）为提取溶剂。

喹诺酮类药物结构中分子都含有羧基和哌嗪基，显示出酸碱两性，易溶于酸性或碱性溶液。通过80%乙腈水（0.1%甲酸）提取后，提取液直接通过PRIME HLB柱净化。PRIME HLB柱是在水可浸润性Oasis吸附剂为基础而特殊设计的一种SPE,它无需活化和平衡步骤能去除95%以上基质干扰物（比如盐，蛋白和磷脂），并且溶液流速更快，使得整个操作更顺畅、快速，且对油脂有很好的净化效果，有很好的适用性，适合推广使用。

3.2 色谱质谱条件优化

本方法优化了色谱质谱条件，采用超高效液相色谱-串联质谱仪检测11种喹诺酮，使用BEHC18色谱柱，以乙腈和0.1%甲酸+2 mmol/L甲酸铵水为流动相，梯度洗脱，流速为0.3 mL/min,能使得11种喹诺酮得到很好的分离，发挥了质谱的高通量特性，使整个分析时间缩短到5.0 min以内，大大地缩短了11种喹诺酮类的分析检测时间，提高检测灵敏度，且无杂质干扰，节省了溶剂的耗费和检测的时间成本。11种喹诺酮类总离子流见图1，阴性猪油样品总离子流见图2。

4 结语

图1 11种喹诺酮类总离子流

图2 阴性猪油样品总离子流

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定动物油脂中11种喹诺酮类药物的检测方法。采用固相萃取柱净化，BEHC18色谱柱超高效液相色谱分离，串联质谱检测器检测。实验结果表明，采用正己烷溶解油脂样品，经PRIME HLB柱净化，BEHC18色谱柱超高效液相色谱-串联质谱法分析，流程简便，结果准确。本方法提取效率高，净化过程简单，灵敏度高，分析时间短，回收率满意，适合推广。