热处理对乳液凝胶微结构的调控作用以及不同维生素贮藏稳定性的影响

鹿 瑶，仇 丹，崔梦楠，高彦祥，毛立科,*

（1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，教育部北京市共建功能乳品重点实验室，中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.宁波工程学院奉化研究院，浙江 宁波 315599）

乳液凝胶又称乳液填充凝胶、乳胶，是一种将乳化的油滴包埋在凝胶基质中的软固体，也是一种良好的新型智能功能因子传递体系[1]。功能因子传递体系，如传统乳液、纳米乳液、脂质体、水凝胶等[2]，可以提高功能因子与食品基质兼容性，确保功能因子在食品生产加工过程中的稳定性及良好的生物利用率[3]。但是，大部分研究主要针对脂溶性功能因子或相似极性功能因子在传递体系中的释放[4]。由于不同极性功能因子稳定性和释放机制存在较大差异，实现多功能因子的同时包埋和释放存在着一定难度[5-6]。而乳液凝胶得益于其独特的双相结构和凝胶网络特性，脂溶性功能因子和水溶性功能因子可以同时分散到油相和凝胶结构当中并得到有效保护[7]。

蛋白质乳液凝胶的制备主要依赖于水相中蛋白质三维网络结构的形成，因此水相的结构化，尤其是蛋白质的结构特性，是影响乳液凝胶性能的核心因素[8]。影响蛋白质结构特性的因素，如温度、离子强度、pH值，都会对乳液凝胶结构特性产生影响[9-11]。通过合理的设计乳液凝胶的物理结构，使其对不同的环境应力有不同的应激特性，可以影响包埋的功能因子的稳定性及释放速率。热处理是对蛋白质进行改性的主要手段之一[12-13]，通过改变球蛋白的结构，诱导蛋白质界面疏水性改变，对蛋白质的聚集和蛋白质在油-水界面的界面活性产生影响[14]。

本研究通过控制热处理时间改变乳清分离蛋白的变性程度，调节乳液水相和油水界面的组成，考察热处理时间对乳液稳定性、乳液凝胶质构及流变特性的影响。通过贮藏实验探究温度对乳液凝胶中不同维生素稳定性的影响，阐释乳液凝胶微结构对复合功能因子稳定性的影响机制，以期为乳液凝胶在功能性食品中的应用和进一步发展提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清分离蛋白（其中包含质量分数为71%的β-乳球蛋白和质量分数为12%的α-乳清蛋白） 美国Davisco公司；玉米油（食品级） 山东三星玉米产业科技有限公司；葡萄糖酸-δ-内酯（glucono-δ-lactone，GDL）（食品级） 上海新洛洛食品有限公司；VE（纯度＞99%） 浙江新和成股份有限公司；异抗坏血酸钠诸城华源生物工程有限公司；无水乙醇（分析纯）、碘、淀粉指示剂 北京化工厂。

1.2 仪器与设备

HWS-24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；T25高速剪切机 德国IKA公司；NS1001L2K高压均质机 意大利GEA NiroSoavi公司；Zeta-sizer Nano-ZS90激光粒度仪 英国马尔文公司；AR1500流变仪美国TA公司；TNS-Pro质构仪 美国FTC公司；3k15离心机 德国Sigma公司；UV-1800紫外-可见分光光度计日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清分离蛋白乳液的制备

配制质量分数为5%的乳清分离蛋白水溶液，利用磁力搅拌器初步混匀；加入质量分数为0.01%的叠氮化钠防止蛋白质腐败；置于4 ℃冰箱中过夜，使蛋白充分水合溶胀并分散在溶液当中；水溶液在85 ℃水浴中分别加热10、20、30 min后，放置于冰浴中迅速冷却；以此溶液为水相制备乳液。

在水相中加入质量分数为0.5%的异抗坏血酸钠，玉米油中加入质量分数为1%的VE，将水相和油相以1∶4（V/V）的比例混合，使用高速剪切机（转速10 000 r/min）剪切1 min制得粗乳液；再通过高压均质机（压力50 MPa）均质3 次获得乳液；所得乳液放置于冰浴中迅速冷却至室温。

除了包埋复合功能因子的乳液外，还制备了只含有VE的乳液作为对照，用来观察复合包埋和单独包埋之间VE稳定性的差异。

1.3.2 乳清分离蛋白乳液凝胶的制备

向所得的乳液中添加质量分数为0.5%的GDL并搅拌均匀，在室温下静置12 h，即获得蛋白质乳液凝胶[15]。预实验表明，两种维生素的添加对乳液粒径、稳定性及凝胶的质构特性无显著影响。

1.3.3 乳液粒径和Zeta电位的测定

采用激光粒度仪测定乳液的粒径与Zeta电位。取100 L样品于试管中，加入20 mL去离子水稀释200 倍体积。测定过程中设折光系数为1.450，25 ℃下保温平衡2 min。为了减少多重散射所造成的误差，每个样品重复测定3 次，取平均值作为最终结果。将制得的乳液在25 ℃和55 ℃下贮藏12 d，每3 d测定乳液的粒径和Zeta电位。

1.3.4 蛋白质乳液及凝胶的流变性质测定

乳液表观黏度的测定：选用流动Ramp模式，将乳液置于平板间，抹去多余样品。流变仪参数：40 mm平行面板（探头），测试温度为25 ℃，间隙设置为1 mm，剪切速率范围为10～400 s－1。乳液凝胶黏弹性测定：选用小振幅动态频率扫描模式，将乳液凝胶置于平板间。流变仪参数：40 mm平行面板（探头），测试温度为25 ℃，间隙设置为3 mm，频率扫描范围为0.01～10 Hz，应变固定为0.1%（应变值在凝胶的线性黏弹区之间）[15-16]。样品周边涂薄层硅油以减少测量过程中水分的蒸发。

1.3.5 蛋白质乳液凝胶质构分析

采用1.3.2节的方法使乳液在25 mL烧杯中成胶，使用质构仪测定凝胶的硬度、弹性、破裂应变和破裂应力。质构仪参数：圆柱型柱塞探头（直径20 mm），在25 ℃的条件下以1 mm/s的速率压缩（形变量50%）2 次，做3 组平行并记录压力-时间曲线。定义硬度为第1次压缩时的最大峰值压力，定义弹性为第2次压缩中所测到的样品恢复高度与第1次压缩型变量之比，即样品经过第1次压缩后能够再恢复的程度。

1.3.6 贮藏过程中蛋白质乳液凝胶中维生素稳定性分析

将含有复合维生素的乳液凝胶充入氮气，然后分别在25 ℃和55 ℃下贮藏12 d，每3 d测定凝胶中维生素的质量浓度，按下式计算维生素的保留率。

1.3.6.1 VE质量浓度的测定

VE质量浓度的测定方法参考GB 1886.233—2016《食品安全国家标准 食品添加剂维生素E》[17]。准确称取含VE的乳液凝胶3.0 g，加无水乙醇25 mL，搅拌，促进VE的溶出，冷却过滤，提取3 次合并滤液；采用分光光度计在284 nm波长处测定滤液的吸收峰；利用标准曲线（y=0.005 2x－0.033 5）计算滤液中VE的质量浓度。

1.3.6.2 D-异抗坏血酸钠质量浓度的测定

D-异抗坏血酸钠质量浓度的测定方法参考GB 1886.28—2016《食品安全国家标准 食品添加剂D-异抗坏血酸钠》[18]。准确称取凝胶样品5.0 g，加30 mL蒸馏水捣碎后水浴加热溶解；在3 600 r/min条件下离心30 min。用注射器吸取下层清液，采用碘滴定法测定清液中异抗坏血酸钠质量浓度。

1.4 数据分析

每组实验至少重复2 次，每个样品至少检测3 组数据，结果用来表示。运用Origin 8.0软件作图，运用SPSS软件对数据进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 热处理时间对蛋白质乳液性质的影响

乳液的稳定性受乳液液滴粒径和Zeta电位等性质的影响[19]，本实验利用激光粒度仪对蛋白质乳液的粒径、Zeta电位进行了表征。粒度特征既可以从微观上确定乳状液分散相的组成特点，又可以从宏观上描述食品乳状液絮凝和聚结等过程[20-21]。根据Stokes规律，体系的颗粒粒径越小，沉淀速度越慢，乳液也就越稳定[5]。图1显示，25 ℃和55 ℃贮藏开始时，蛋白质溶液热处理时间越长，乳液液滴粒径越小，这可能是由于加热时间的延长提高了蛋白质变性的程度，促进了疏水基团的暴露，增强了蛋白质的乳化效果，使得更多的油滴能被乳化剂充分覆盖，防止了油滴的聚集。Liang Yichao等[22]也得出了相似的结论，他们发现展开的蛋白质分子在油相界面重新排列形成界面膜，抑制了油滴的聚集和絮凝现象，提高了乳液的稳定性。而在Wang Xufeng等[23]的研究中，蛋白经过加热预处理后乳液的粒径却增大了，这可能是由于该实验的加热温度（90 ℃）过高，造成了大量蛋白质聚集，从而不能有效吸附到油滴的表面。而随着贮藏时间的延长，各实验组的乳液粒径均呈现上升趋势，观察粒径分布（乳液的粒径分布代表的是液滴尺寸和颗粒浓度之间的关系）的变化可以得出一致的结果，且在55 ℃贮藏条件下，乳液粒径上升的幅度更大：10 min组从开始的306 nm到贮藏结束时达到374 nm；20 min组从开始的300 nm到贮藏结束时达到347 nm；30 min组从开始的294 nm到贮藏结束时达到325 nm。而在25 ℃贮藏条件下，10 min组乳液粒径从开始的306 nm到贮藏结束时为320 nm；20 min组从开始的300 nm到贮藏结束时为319 nm；30 min组从开始的294 nm到贮藏结束时为309 nm。这说明乳液粒径除了受热处理时间的影响外，还在一定程度上由贮藏环境温度所决定，贮藏温度越高，油滴的聚集速度越快，乳液粒径增加，乳液会更快失稳。

当蛋白质等表面活性物质吸附到油滴表面时，可以使油水界面具有与该表面活性物质相同的带电性，且表面电位强度（Zeta电位绝对值）越高，乳化油滴之间的静电排斥作用就越强，可以有效地阻止液滴的相互靠近和聚集[24]。从表1乳液凝胶Zeta电位的测定结果可以推断出相似的结论，乳液体系的pH值在6.8左右，高于乳清分离蛋白的等电点pH 4.5，所以体系油滴表面带负电。整体来说乳液的Zeta电位强度维持在30～40 mV左右，但随加热时间的延长，乳液的Zeta电位强度也略微增加，进而导致分子间的静电相互排斥作用增强，增加乳液的稳定性。随着贮藏时间的延长，乳液的Zeta电位强度呈下降趋势，液滴之间的静电排斥作用会减弱，也导致了乳液的进一步失稳。而通过流变仪观察乳液的表观黏度随着剪切速率（50～400 s－1）的变化（图2），可以看出热处理时间对乳液的表观黏度无明显影响。

图1 不同贮藏温度下不同加热时间的乳液粒径随贮藏时间的变化及25 ℃贮藏条件下的粒径分布变化Fig. 1 Variation in particle size of emulsions stabilized by WPI undergoing different durations of heat treatment as a storage temperature and storage time and variation in particle size distribution of each treatment group during storage at 25 ℃

表1 不同贮藏温度下乳液Zeta电位随贮藏时间的变化Table 1 Variation in zeta-potential of emulsions as a function of storage temperature and time

图2 热处理时间对蛋白质乳液表观黏度的影响Fig. 2 Effect of heat treatment time on apparent viscosity of WPI emulsions

2.2 热处理时间对蛋白质乳液凝胶性质的影响

本研究中乳液凝胶的形成主要分为2 步：1）蛋白质的二级结构在蛋白水溶液（中性pH值、低离子强度、加热温度低于热凝胶的临界温度）的热处理过程中去折叠，逐渐展开，疏水基团暴露并吸附在油滴表面，同时界面相蛋白的亲水基团与连续相的其他蛋白通过静电作用交联聚集；2）向制得的乳液中添加GDL，GDL水解产生葡萄糖酸[25]，导致乳液体系的pH值逐渐降低，直到接近蛋白质的等电点（pH 4.6）时，蛋白质表面电荷被中和，然后在疏水作用、静电作用、二硫键等共同作用下蛋白质分子或聚集体之间互相交联缔合形成三维凝胶网络结构[26]。所以热处理通过影响蛋白质的变性程度对凝胶的结构和性质产生很大的影响[27]。均质过程虽然有热量产生，但温度上升不会超过40 ℃，与高温热处理（85 ℃）相比并不足以引起蛋白的明显变性，所以其影响可以忽略不计。图3展示了不同加热时间下乳液凝胶的外观形貌。可以直观地看到，加热10 min和20 min形成的凝胶质地形态较柔软，尤其是10 min组形状最为松散，而加热30 min形成的凝胶结构较为致密，形状也更为规整。

表2乳液凝胶的质构数据显示出了与图3一致的结果：随着加热时间的延长，凝胶的硬度、破裂应变增大，10～20 min有明显增加。这应该是由于充足的加热时间保证了蛋白质结构的充分展开，暴露出更多的疏水基团，促进了蛋白质聚合物的交联和凝胶网络的形成。而且从数据变化来看，在10～20 min时凝胶的硬度、破裂应力等有了一个较大的变化，但20～30 min的数据差异并不大，说明蛋白质的变性程度与加热时间并不是简单的线性关系。除去加热未完全的10 min，虽然加热20 min组比加热30 min组形成的凝胶的硬度小，但是凝胶弹性却稍大，可能与其形成的凝胶网络刚性更弱有关。

图3 热处理时间对乳液凝胶外观的影响Fig. 3 Effect of heat treatment time on the appearance of emulsion gels

表2 热处理时间对乳液凝胶质构性质的影响Table 2 ffect of heat treatment time on texture properties of emulsion gels

表2 热处理时间对乳液凝胶质构性质的影响Table 2 ffect of heat treatment time on texture properties of emulsion gels

指标 10 min 20 min 30 min硬度/N 0.35±0.04 2.17±0.07 2.41±0.05弹性/mm 0.17±0.27 6.85±0.27 6.65±0.26破裂应变/mm 0.12±0.09 6.73±0.44 9.15±0.73破裂应力/（N/mm） 1.51±0.19 0.36±0.06 0.36±0.03

图4 热处理时间对频率扫描中乳液凝胶G'（A）和G”（B）的影响Fig. 4 Effect of heat treatment time on storage modulus (G') (A) and loss modulus (G”) (B) of emulsion gels

乳液凝胶过程中储能模量（G'）的增加被认为是蛋白凝胶强度或硬度增加的表现[15]。分析图4乳液凝胶的频率扫描可以得出类似的结论，热处理时间的延长可以提高乳液凝胶的G'，增强乳液凝胶的强度。除此之外，随着频率的不断升高（0.01～10 Hz），乳液凝胶的G'和损失模量（G”）均呈现上升趋势。加热10 min的样品G'从843 Pa上升到了2 861 Pa，G”从210 Pa上升到了1 499 Pa；加热20 min的样品G'从1 857 Pa上升到了4 815 Pa，G”从434 Pa上升到了653 Pa；加热30 min的样品G'从2 127 Pa上升到了7 197 Pa，G”从927 Pa上升到了2 261 Pa。研究表明，相较于典型的强凝胶体系，凝胶的G'和G”基本不依赖于频率变化[28]，在弱凝胶体系中，两者的增加则对频率具有依赖性[29]。所以推断本实验中设计的蛋白质乳液凝胶应该为弱凝胶体系。

2.3 蛋白质乳液凝胶中复合维生素的稳定性

乳液凝胶既具有水凝胶的热力学稳定性，又具有乳液传递脂溶性功能因子的特性[1]，功能因子分散于乳液凝胶结构当中，一方面受到凝胶的保护；另一方面被凝胶结构固化，因此具有较高的理化稳定性。通过设计乳液凝胶的物理结构，使其对环境应力具有不同的应激性，可以改变被包埋功能因子的稳定性及释放特性，进而提高功能因子生物利用率[30-31]。

本实验将乳液凝胶贮藏在不同温度下，测定其中VE和异抗坏血酸钠的含量变化，计算其保留率，分析乳液凝胶结构对复合维生素稳定性的影响规律。图5显示，乳清分离蛋白加热处理时间和贮藏温度对VE的保留率都有着明显的影响。乳清分离蛋白加热时间越长，VE的保留率越高，降解速率越慢，稳定性越好。在25 ℃贮藏条件下，起初VE的保留率下降较缓慢，但贮藏中后期随着凝胶结构的破坏，VE的保留率也明显降低，贮藏28 d后保留率仅为40%左右；而在55 ℃贮藏条件下，VE的保留率下降速率要高于常温贮藏时，说明高温促进了体系中VE的氧化降解。

图5 热处理时间对贮藏过程中V稳定性的影响Fig. 5 Effect of heat treatment time on the stability of VE during storage

由图6可知，与VE降解规律类似，异抗坏血酸钠的降解与乳清分离蛋白加热处理时间和凝胶贮藏温度也有着密切的关系。可直观地看出，在25 ℃贮藏条件下，加热时间越长，异抗坏血酸钠的保留率越高，稳定性越好。因为凝胶在贮藏过程中会发生析水现象，加热时间越短，凝胶结构越松散，析水的现象越明显，导致异抗坏血酸钠随着水分迁移到凝胶外部甚至表面，失去凝胶的保护作用。但在高温（55 ℃）的贮藏条件下，热处理时间对其保留率却没有明显的影响，且在贮藏12 d时异抗坏血酸钠的含量已经接近于0，同时期25 ℃条件下其保留率仍为60%左右。这说明贮藏温度对异抗坏血酸钠稳定性的影响大于热处理时间。同时，对比VE和异抗坏血酸钠的降解速率，可以看出后者的降解速率更快，这可能是由于异抗坏血酸钠主要分布于水相中，更易直接受到光热氧的影响，且它作为抗氧化剂对VE起到了一定程度的保护作用。

图6 热处理时间对贮藏过程中异抗坏血酸钠稳定性的影响Fig. 6 Effect of heat treatment time on the stability of sodium erythorbate during storage

为了进一步研究乳液凝胶中复合维生素抗氧化的作用机制，研究连续相中异抗坏血酸钠对油相中VE稳定性的影响，本实验对比了不同加热时间单独包埋VE和复合包埋2 种维生素条件下，VE贮藏保留率的变化。由图7可知，在3 组不同的加热时间及25 ℃贮藏条件下，复合包埋的VE保留率均高于单独包埋，且加热时间越长VE的稳定性越好，尤其是在单独包埋的条件下保护效果更明显。这说明复合包埋可以在一定程度上提高油相中VE的稳定性，连续相中的异抗坏酸钠的确对VE起着一定的抗氧化作用。

图7 单独包埋和复合包埋对贮藏过程中VE稳定性的影响Fig. 7 Effects of incorporation of VE alone and in combination with sodium isoascorbate on VE stability during storage

3 结 论

通过控制热处理时间可以调整蛋白质的变性程度，对蛋白质乳液的性质和乳液凝胶的结构产生明显影响。热处理时间较长的蛋白质乳液具有更小的粒径和更大的Zeta电位强度，形成的乳液凝胶质地更致密，硬度和强度也更大。因此，通过改变蛋白质热处理的时间可以有效调控乳液凝胶的结构性质。另一方面，蛋白质乳液凝胶可以同时包埋两种不同极性的维生素，维生素的稳定性与乳液凝胶的微结构密切相关。VE和异抗坏血酸钠的稳定性随凝胶中蛋白质加热时间的延长而增大，且复合包埋条件下VE的降解速率更低。本研究结果表明，蛋白质乳液凝胶可以作为不同极性功能因子的传递体系，提高功能因子的稳定性，为进一步开发新型功能食品提供理论依据和技术支撑。