探讨TNF-α、IL-6对体外培养胎鼠成骨细胞中串珠素表达的影响

翟连锁，李琳，赵桂芳

（济南市济阳区人民医院，山东 济南 251400）

骨具有强大的修复、再生功能，在骨折愈合过程中，成骨细胞主要合成骨基质，起着非常重要的作用。TNF-α、IL-6等细胞因子具有多种生物学功能，在骨折愈合中是很强的骨吸收刺激因子，可以促使破骨细胞分化形成。此外，有大量研究显示，TNF-α、IL-6会抑制成骨细胞，进而影响骨折的愈合，但是其确切机制还未研究清楚。串珠素（也叫基底膜蛋白多糖）可影响细胞和基质间的粘附，在软骨发育、血管生成中起着非常重要的作用，有研究显示串珠素还可促进神经纤维的修复。在骨折愈合时，成骨细胞会表达一定的串珠素，串珠素有利于骨折的愈合[1]。本次研究以期通过研究一定浓度的TNF-α、IL-6对体外培养胎鼠成骨细胞中串珠素mRNA表达的影响，找出一种抑制成骨细胞活动的机制，加以干预，促进骨折愈合的治疗。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物：10只新生SD大鼠（24 h）。实验试剂：DMEM培养基、胎牛血清、RT-PCR试剂盒、0.25%胰蛋白酶等。实验仪器：CO2培养箱、酶标仪、PCR仪等。

1.2 实验方法 通过酶消化方法提取胎鼠颅盖骨成骨细胞，并进行传代培养。在6孔培养板中，以105/mL密度接种传代培养的第3代成骨细胞，每孔100 mL细胞悬液，在37oC下培养24 h。将细胞分为3组（6孔/组）：A组加入等量细胞培养液；B组加入10 ng/mL TNF-α；C组加入100 ng/mL IL-6。在24 h、48 h、72 h时，收集每孔细胞，根据RT-PCR试剂盒说明书中步骤提取总RNA，使用特异性引物进行RNA的反转录，最后进行琼脂糖凝胶电泳检测，并通过Quantity one软件测定扩增条带的灰度值，计算灰度比值。

1.3 统计学方法 通过SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析；计数资料采用率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在10 ng/mL TNF-α、100 ng/mL IL-6干扰下，24 h、48 h、72 h胎鼠成骨细胞串珠素表达量均显著降低（P＜0.05），具有统计学意义，见表1。

表1 对比分析各组细胞串珠素mRNA灰度比（Mean±SD）

3 讨论

机体中有TNF-α、IL-1/6等骨吸收刺激因子，作用靶目标为破骨细胞、成骨细胞，不仅会影响成骨细胞的活性，还会促使破骨细胞活性的增加[2]。所以，如果骨吸收刺激因子的表达过度，会使得丧失骨质多于形成的骨质，进而导致骨质疏松的发生，大幅度增加了骨折的发生率；此外，还会使得骨折愈合时间延长，严重的情况下可能会导致骨折不愈合的问题。大量研究显示，TNF-α、IL-1/6等骨吸收刺激因子可促进破骨前体细胞的分化，激活NF-kB通路，反作用于TNF-α、IL-1/6，增加其表达量。

目前对骨吸收刺激因子的研究主要集中在破骨细胞的代谢、分化以及增殖等方面，有关对成骨细胞影响的研究比较少。TNF-α可抑制成骨细胞活性，但是其机制非常复杂，目前还未研究清除。在人体中，TNF-α受体是一种对抗成骨细胞强化因子的介质，TNF-α会抑制骨基质合成、成骨细胞分化，进而抑制骨形成。此外，细胞凋亡是TNF-α介导抑制的重要通路之一。相关研究表明，在一定浓度TNF-α作用下，成骨细胞会发生凋亡坏死。有研究人员通过大鼠实验研究了骨折愈合过程中TNF-α的变化情况，结果显示骨折部位牵引会影响骨痂的形成，部分骨组织中TNF-α表达量显著上升，可影响骨折的愈合。有研究人员对吸烟对骨折愈合中TNF-α的表达进行了研究，结果显示吸烟会使TNF-α表达量增加，进而使得骨折愈合时间延长。临床上，有研究人员发现骨折、手术创伤会使得患者体内TNF-α、IL-6表达显著增加，并且随着创伤时间的延长，其表达量慢慢减小。在绝经后骨质疏松的发生中，IL-6因子起着非常重要的作用。上述研究均在一定程度上表明了骨折愈合中，TNF-α、IL-6起着非常重要的作用，然而大部分是以大鼠、小鼠等为实验对象，在细胞水平上的研究比较少。

人体中，TNF-α、IL-6是非常重要的炎症因子，过度表达会造成MODS，也是导致创伤、烧伤等患者死亡的重要因素[3]。临床上，已经开始使用IL-1受体拮抗剂、肿瘤坏死因子单抗等炎症介质类药物治疗SIRS过度反应造成的MODS上，但是其实际疗效还需要深入研究。在骨折不愈合患者中，TNF-α、IL-6等的表达显著升高，会影响骨折的愈合。目前，有关TNF-α、IL-6对骨折愈合的影响主要集中在破骨细胞方面，对成骨细胞（特别是分子水平）的研究相对较少。目前，已经有研究对串珠素、骨折不愈合间的关系进行了研究，结果显示在骨折愈合中，串珠素起着非常重要的作用，会对骨折愈合产生一定的影响。在骨折愈合中，IL-6、IL-1、TNF-α之间是协同还是拮抗作用依然需要深入地研究，在临床上可寻找一条新的道路，找出影响骨折愈合的一种因素，进而为骨折不愈合的治疗提供新的治疗方法。