肝螺杆菌LAMP快速检测方法的建立及初步应用

冯 洁 ，张 泉 ，钱 淼 ，谢建云 ，胡建华 ，高 诚 ，高 崧

（1.扬州大学兽医学院，扬州 225009；2.上海实验动物研究中心 上海市实验动物质量监督检验站，上海201203）

肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus，H. hepaticus）是一种革兰氏阴性、微需氧、螺旋弯曲状细菌，最早由美国国家癌症研究院Fox等[1]在雌性A／JCr小鼠的肝细胞癌和慢性活动性肝炎的肝组织中发现。该菌呈世界性分布，已从多种哺乳动物的胃肠道和肝组织中成功分离，可引起宿主多种肝肠疾病，影响动物健康，干扰实验结果[2-5]。国外实验动物相关标准普遍要求实验大鼠、小鼠须排除该病原体。我国实验动物国家标准尚未将其纳入微生物控制列表，2017年中国实验动物学会制定发布团体标准并将螺杆菌列入其中，该标准规定了实验动物螺杆菌的PCR检测方法，适用范围包括实验动物及其产品、细菌培养物、实验动物环境及动物源性生物制品中螺杆菌的检测，这对于我国实验动物质量保证和提升起到了促进作用。目前该菌的检测方法主要是分离培养和PCR检测等手段，随着我国实验动物管理和标准化要求的不断提高，建立快速、准确、适宜推广的肝螺杆菌检测方法尤为必要。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等[6]报道的一种快速核酸扩增技术。特点在于恒温条件下利用特异性引物及链置换DNA聚合酶的作用对模板进行高效扩增。该技术特异性好、灵敏度高、高效简便，反应结果可通过反应副产物焦磷酸镁白色沉淀进行肉眼观察直接判定，无需特殊、昂贵仪器，适宜基层推广，近年来在疾病诊断、食品安全等方面得到广泛应用[7]。鞭毛蛋白B（fla B基因编码）是肝螺杆菌的重要毒力因子，保守性强，本研究针对fla B保守区域设计一组特异性引物，目的在于建立一种快速、特异、灵敏的肝螺杆菌LAMP检测方法，为肝螺杆菌的监测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株肝螺杆菌ATCC 51449、胆型螺杆菌ATCC 51630、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、绿脓杆菌ATCC 27853、嗜肺巴斯德杆菌ATCC35149、啮齿柠檬酸杆菌ATCC 51116、牛棒状杆菌ATCC 7715均购自美国标准生物品收藏中心；肺炎克雷伯杆菌CMCC 46117、鼠伤寒沙门氏菌 CMCC50115、福氏志贺菌CMCC 51572、粪产碱杆菌CMCC 40001均购自中国医学微生物菌种保藏管理中心。

1.2 主要试剂脱氧核糖核酸扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；TaqDNA聚合酶、PCR buffer、Mg2+、2×TaqPlus Master Mix（Dye Plus）购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker购自TAKARA公司；琼脂糖购自西班牙Bio-west公司；GoldViewTM核酸染料购自上海赛百盛（SBS）基因技术有限公司。

1.3 引物设计与合成根据GenBank公布的肝螺杆菌fla B基因序列，利用LAMP在线设计软件针对保守区域设计1套LAMP引物，包括2条外引物、2条内引物和1条环引物，引物序列见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。表1中F3/B3为LAMP扩增外引物，FIP/BIP为LAMP扩增内引物，LB为环引物。

表1 LAMP扩增引物序列Table 1 LAMP primer sequences

1.4 基因组DNA提取按照TIANGEN细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书进行操作，提取细菌基因组DNA，紫外分光光度计测定OD260/OD280在1.6～2.0范围内，-20℃保存备用。

1.5 LAMP方法的建立与优化25 μL LAMP反应体系：5 μmol/L的外引物F3/B3各1 μL；40 μmol/L的内引物FIP/BIP各1 μL，20 μmol/L的反向环引物LB 1 μL，2×反应缓冲液12.5 μL，BstDNA聚合酶1 μL，荧光染料1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O补足至25 μL体系。设未加入模板的体系作为阴性对照。将反应管置于实时浊度仪LA-320c（日本荣研化学株式会社）内反应并绘制曲线，曲线上升表示发生扩增反应即为阳性。为确保反应精确性，分别在59℃、61℃、63℃、65℃、67℃扩增温度下，设定反应时间为30～75 min，对反应温度、反应时间进行优化。扩增产物可经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测或通过荧光染料目测观察。取2 μL扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，若出现LAMP特征性的梯形带则判为阳性，未出现扩增条带则判为阴性。在LAMP反应结束后反应管目测出现绿色荧光判为阳性，橙色则判为阴性。

1.6 LAMP特异性检测以肝螺杆菌基因组DNA为阳性对照模板，灭菌ddH2O为阴性对照模板，胆型螺杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、啮齿柠檬酸杆菌、牛棒状杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺菌和粪产碱杆菌的基因组DNA为模板进行LAMP扩增，进行特异性检测。

1.7 LAMP灵敏度检测将肝螺杆菌基因组DNA模板进行10倍倍比稀释，对不同浓度的DNA模板进行LAMP扩增，以确定最低检测限。同时采用中国实验动物学会团体标准T/CALAS 24-2017实验动物螺杆菌PCR检测方法[8]进行检测，比较两种方法的灵敏度差异。

1.8 临床应用无菌采集52只SPF级小鼠回盲部内容物0.2 g，悬浮于1 mL PBS（pH7.4）中制成悬液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。分别采用本文建立的LAMP检测方法和常规PCR方法进行检测，对检测结果进行分析。

2 结果

2.1 LAMP检测方法的建立为优化扩增条件，对不同反应温度和反应时间进行摸索。在选定的不同扩增温度下，30～75 min反应时间内阳性核酸扩增效率和阳性核酸出峰时间差别不大，故选择63℃扩增温度、45 min反应时间作为最佳反应条件。如图1所示，采用本研究建立的LAMP扩增体系对样品进行扩增，结果经电泳检测可见典型梯状条带，阴性对照未见条带。初步表明本研究建立的LAMP扩增方法可行。

图1 肝螺杆菌LAMP扩增结果检测Fig.1 LAMP detection of H. hepaticus

2.2 LAMP特异性检测分别以胆型螺杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、啮齿柠檬酸杆菌、牛棒状杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺菌、粪产碱杆菌的基因组DNA为模板进行LAMP扩增，肝螺杆菌基因组DNA为阳性对照模板，灭菌纯净水为阴性对照模板，结果见图2、3。如图2所示，仅肝螺杆菌出现上升性扩增曲线，说明发生特异性扩增，而其他菌株均未出现扩增，表明建立的LAMP检测方法特异性良好。

图2 特异性试验LAMP扩增图Fig.2 LAMP ampli fication of speci ficity test

2.3 LAMP灵敏度检测以8.69 μg/μL的肝螺杆菌基因组DNA为起始浓度，按10倍倍比稀释后进行敏感性试验。结果显示本研究建立的LAMP方法能够检出的最低模板量为86.9 fg/μL（图4）。常规PCR方法能够检出的最低模板量为869 fg/μL（图5）。

2.4 临床应用应用本文建立的LAMP检测方法和团体标准推荐PCR方法对52份样品进行检测。结果显示，LAMP阳性检出率为88.46%（46/52），常规PCR阳性检出率为80.77%（42/52），LAMP方法的阳性检出率较常规PCR高7.69%，二者符合率为92.31%。

3 讨论

肝螺杆菌是一种重要的人兽共患病原体，主要以隐性感染方式定植于动物下消化道（盲肠、结肠、肝胆管系统），呈宿主依赖型，可引起慢性肝炎、盲肠结肠炎、胆肝炎甚至肝癌、肝胆管腺瘤、结肠癌等病变，影响小鼠免疫应答，可刺激宿主肝脏巨噬细胞、肝细胞和单核淋巴细胞产生TNF-α、IFN-γ、IFN-α/β、IL-6、IL-8、IL-17等[9-11]，严重影响实验动物的质量，干扰实验结果，被公认为是啮齿类实验动物的重要致病菌[12]。近年来围绕肝螺杆菌与人类疾病尤其是肝胆疾病的相关研究已开展。报道显示，在慢性病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌患者的癌组织中可扩增出螺杆菌16S rRNA基因片段，推测肝螺杆菌可能与人类肝脏疾病的发展有关联，可能会增加已被乙型或丙型肝炎病毒感染患者的癌变率[13-16]。由于肝螺杆菌存在潜在的人与动物交叉传播的致病性[17]，因此对于动物质量控制以及公共卫生而言，建立可靠的肝螺杆菌快速检测方法具有重要意义。

图3 LAMP特异性试验Fig.3 Speci ficity test of LAMP

图4 LAMP敏感性试验Fig.4 Sensitivity test of LAMP

图5 PCR敏感性试验Fig.5 Sensitivity test of PCR

表2 LAMP和PCR方法的比较Table 2 Comparison of LAMP and PCR

肝螺杆菌实验室检测方法主要为分离培养、血清学和PCR等分子生物学方法。分离培养是细菌检测的金标准，该方法根据细菌生物学特性、表型特征进行鉴定，但存在操作繁琐、周期长、敏感性低等缺陷。肝螺杆菌为微需氧菌，营养条件苛刻，生长缓慢且在体外稳定性差，通常需2～3周才能获得检测结果，敏感性差。经初次分离后传代培养时易发生球形裂变或丝状体，处于休眠状态呈现非可培养活性状态，当细菌死亡或带菌量很少时通常造成漏检[18-19]，故培养法不适于该菌的快速检测和大批量样品筛查。血清学方法主要是检测动物血清中的抗体。该方法操作简便、高效，可在同一时间内检测大量样品，但对抗原制备要求高，由于不同血清型螺杆菌之间抗原同源性较高，易出现非特异性结合造成假阳性结果[20]。常规分子生物学方法如PCR等，具备快速、特异、灵敏的特点，已在病原体快速诊断中得到广泛应用，尤其是培养方法受限的病原体更为适合。当前实验动物国际先进标准普遍采用PCR方法对肝螺杆菌进行监测，但PCR检测过程需昂贵的扩增仪等设备支持，限制了该方法在一线现场的推广应用。LAMP利用一种链置换DNA聚合酶（BstDNA polymerase）和2对特殊引物，特异性识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下（65℃左右）保温数10 min，即可完成核酸扩增。该技术因具备简单、快速、灵敏、特异、易于推广等优势，尤其适合于野外现场使用，已广泛应用于病原体的快速检测和早期诊断[21-23]。

本研究针对肝螺杆菌鞭毛蛋白B基因（fla B）保守区域设计一组LAMP扩增特异性的引物，对新建LAMP检测方法进行特异性和敏感性分析。鞭毛抗原，又称H抗原，不仅决定了细菌在细胞表面的吸附、侵袭和定居过程，还是细菌重要的表面抗原，是肝螺杆菌重要的毒力因子。目前已知肝螺杆菌Hh的鞭毛合成系统编码两种类型的鞭毛蛋白A和B，fla B编码514个氨基酸组成多肽。有研究表明，不同菌株间鞭毛蛋白的同源性很高，具有很高的保守性，可以作为Hh诊断的候选基因之一[24-25]。实验结果显示，LAMP扩增在恒温条件下短时间内即可完成检测，特异性好，灵敏度较常规PCR高，操作简便，检测结果可直接通过肉眼实现可视化观察，无需开盖进行电泳，即节省时间又可避免核酸污染检测场所。临床样本应用试验显示本文建立的LAMP方法敏感性较PCR方法高，PCR方法检测呈阳性的样品均能被LAMP方法检测出，二者符合率达92.31%。

综上，本研究建立了肝螺杆菌LAMP快速检测方法，与现有技术相比，该方法不受培养条件和检测仪器的限制，具备简便、快捷、特异、灵敏的优势，结果可视化，适宜基层推广应用，为肝螺杆菌的快速检测提供了技术支撑。