上海地区幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的相关基因检测

黄声雷， 郭 玮， 胡必杰， 周春妹， 潘柏申

幽门螺杆菌（Hp）对克拉霉素耐药是由于该菌的23S rRNA基因发生了某个位点突变导致了核糖体构象改变，使大环内酯类抗生素结合位点也随之发生改变，从而干扰了克拉霉素与细菌结合而产生耐药。1996年Stone等[1]发现并报道了Hp对克拉霉素耐药的分子基础主要是23S rRNA基因中2143位点上A突变为G。在我国Hp 23S rRNA基因2143单位点的突变是导致对克拉霉素耐药的主要原因。2001年研究显示北京地区耐克拉霉素的Hp 23S rRNA基因A2143G突变率高达100%[2]，2008年淮南地区耐药Hp A2143G的突变率也高达100%[3]。

随着分子生物学技术的发展，常用PCR方法如PCR限制性片段长度多态性分析技术、荧光PCR原位杂交、23S rRNA基因组测序等被推荐用于检测Hp的耐药性。为了了解上海地区耐克拉霉素Hp的23S rRNA基因突变情况，同时为了提高样本Hp检测的阳性率，本研究使用两种不同PCR方法，包括测序方法和荧光PCR熔解曲线法，直接对快速尿素酶试验筛查Hp阳性患者的胃黏膜组织标本进行Hp耐药基因的检测，评估两种检测方法结果的一致性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 2017年9-12月因上消化道症状于复旦大学附属中山医院接受胃镜检查患者，选取快速尿素酶试验Hp阳性患者的尿素酶试管中废弃的胃黏膜组织标本80份。

1.1.2 主要试验材料 自动化样品研磨匀浆器和无菌去热源钢珠（TissueLyserⅡ） 购自德国QIAGEN公司，商品化自动核酸提纯及荧光PCR分析仪TCG-D1型由踏石生物科技苏州有限公司提供；配套商品化试剂盒包括聚合酶试剂（KOD Mix）；引物HPC-F5'-GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCC-3，HPCR5'-GGCTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3'；荧光探针序列：5'-CAAGACGGAAAGACCC-3'；氟硼二吡咯荧光染料 （HPC Mix）；样本稀释液（含1%磷酸缓冲液和99%无菌水）；样本萃取液（含1%pH调整剂的无菌水溶液），商品化试剂盒由踏石生物科技苏州有限公司提供；DNAiso试剂盒和Ex Taq DNA聚合酶购自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 将胃黏膜组织标本放入含有0.9%NaCl溶液1.5 mL平底无菌离心管中，向管内放入无菌去热源直径为0.2 cm钢珠，将离心管固定在自动化样品研磨匀浆器，来回振荡研磨。设置仪器参数为：震荡频率60次/min，时间15 min。取180 μL样本稀释液和200 μL胃黏膜组织匀浆移至0.5 mL无菌离心管中；12 000 r/min室温离心5 min，弃上清液向含沉淀物的离心管中加入50 μL样本萃取液，涡旋振荡混匀5～6 s；将离心管放置于95 ℃恒温孵育箱5 min备用。

1.2.2 全自动核酸提纯及荧光PCR分析仪操作 根据厂家提供的商品化PCR仪配套分析软件GENECUBE-TCGS操作说明，设置PCR扩增反应以及检出参数如下：待机温度 35 ℃，预变性94 ℃ 30 s，变性 97 ℃ 1 s，退火 60 ℃ 3 s，延伸63 ℃ 5 s，待机温度 35 ℃（变性-延伸的循环次数均为50次）。检出参数：94 ℃ 30 s，39 ℃ 30 s，40～75 ℃，温度上升速度为0.09 ℃/s。

1.2.3 检测结果判读 荧光微分值≥10，且熔解曲线峰值所在的熔解温度在50～60 ℃，提示Hp菌群阳性及23S rRNA基因2142和2143位点无突变；荧光微分值≥10，且熔解曲线峰值所在的熔解温度在42～50 ℃，提示Hp菌群阳性及23S rRNA基因2142或2143位点有突变；荧光微分值＜10，内部质控荧光微分值≥1.0，且其熔解曲线峰值所在的熔解温度在42～68 ℃，提示Hp菌群阴性。

1.2.4 DNA测序方法 直接检测样本Hp及耐药基因，参考DNAiso试剂盒说明书抽取胃黏膜组织匀浆中的DNA，针对克拉霉素耐药Hp基因23S rRNA的核酸序列设计用于PCR的引物，在NCBI中查找参考序列，使用软件Primer Premier 3.0进行设计引物（由深圳华大基因股份有限公司合成），Hp 23S rRNA 上游引物A2142+A2143-F，5'-TTACCAAAAACACAGCA-3'；Hp23S r R N A 下游引物A 2 1 4 2+A 2 1 4 3-R，5'-CTCCATAAGAGCCAAAG-3' PCR扩增反应的反应体系50 μL为：10×反应缓冲液5 μL 、dNTP 4 μL、引物各1 μL、Ex Taq 0.25 μL、模板1 μL 和无菌双蒸水37.75 μL。PCR反应条件为： 96 ℃，预变性5 min；95 ℃，变性20 s； 52 ℃退火45 s；72 ℃延伸60 s， 共45个循环。PCR扩增产物的纯化和测序，交由深圳华大基因股份有限公司完 成。

1.2.5 统计学方法 将资料和结果使用Excel建立数据库，应用SPSS 20.0统计软件，使用卡方检验分析不同年龄段、性别、病种类型对Hp 23S rRNA第2142或2143位点变异的影响，当P＜0.05表示两者差异有统计学意义。总结两种试验方法的定性检测结果，计算阳性符合率、阴性符合率和总符合率，并对定性检测结果进行Kappa检验以验证两种方法结果的一致性。Kappa值≥0.75表示两者一致性较好[4]。

2 结果

2.1 基本资料

本研究中，提供80份胃黏膜组织的患者年龄17～83岁，平均（53.6±13.9）岁；其中男40例，女40例。检测Hp阳性患者临床诊断包括慢性浅表性胃炎35例、慢性萎缩性胃炎21例、慢性糜烂性胃炎4例、胃溃疡6例、胃癌2例和胃黏膜息肉1 例。

2.2 荧光PCR熔解曲线法检测结果

使用荧光PCR熔解曲线法对80份快速尿素酶试验Hp阳性患者的胃黏膜组织标本进行检测，共69份样本Hp阳性，11份Hp阴性，阳性率为86.2%。在69份Hp阳性的标本中24份标本存在23S rRNA第2142或2143位点的变异（突变株），45份标本未检测到位点突变（野生株），突变率占34.8%。本次试验中男性患者组和女性患者组的Hp 23S rRNA第2142或2143位点突变率分别为29.4%（10/34）和40.0%（14/35），差异无统计学意义（P=0.356）。

Hp阳性患者按年龄分为老年（≥60岁）和非老年（17～59岁）两组。结果显示老年组和非老年组的Hp 23S rRNA第2142或2143位点突变率分别为36.4%（8/22）和34.0%（16/47），差异无统计学意义（P=0.850）。

Hp阳性患者按照不同消化道疾病分为慢性浅表性胃炎组35例、慢性萎缩性胃炎组25例（包括慢性萎缩性胃炎21例和慢性糜烂性胃炎4例）和溃疡组9例（包括胃溃疡6例、胃癌2例和胃黏膜息肉1例）。结果显示浅表性胃炎组、萎缩性胃炎组和溃疡组的Hp 23S rRNA第2142或2143位点突变率分别为34.3%（12/35）、36.0%（9/25）和33.3%（3/9），差异无统计学意义（P=0.986）。

2.3 DNA测序结果

80份快速尿素酶试验Hp阳性患者的胃黏膜组织标本使用DNA测序法共检测64份Hp阳性，16份Hp阴性，阳性率为80.0%。在64份Hp阳性的标本中23份标本检测到23S rDNA耐药基因的突变，41份标本没有检测到基因突变，突变率35.9%。23株Hp突变株均为单位点突变，其中2142位点突变率为0，2143位点突变率为100%，19株为2143位点GG突变型，4株为2143位点AG杂合型。Hp野生型、杂合型和突变型的DNA核苷酸序列检测结果见表1。

表1 Hp野生型、杂合型和突变型的DNA核苷酸序列检测结果Table 1 DNA nucleotide sequencing results in wild-type, heterozygous, and mutant H. pylori

2.4 两种方法对Hp核酸的有效检测一致性评价

两种方法阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为100%、68.8%和92.5%，Kappa系数为0.779。

2.5 两种方法对Hp耐药基因突变的一致性评价

本实验使用两种方法共同检测64份阳性样本Hp 23S rRNA第2142或2143位点突变。其中荧光PCR熔解曲线法检测Hp耐药基因突变株22例，野生株42例。DNA测序法检测Hp耐药基因突变株23例，野生株41例。阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为87.0%、95.1%和92.2%，Kappa系数为0.829。

3 讨论

2017年中华医学会消化病学分会发布的抗Hp感染共识中推荐使用经典铋剂四联根治方案[5]。然而在实际应用中，四环素和呋喃唑酮药物不良反应风险较大且难以广泛获得；甲硝唑耐药率高，于2017年被世界卫生组织列为2B类致癌物，因此克拉霉素被广泛推荐用于Hp根除治疗的一线方案[6]。但随着我国克拉霉素在抗感染等领域的广泛使用，Hp对其敏感率逐年下降，这成为含克拉霉素根除治疗方案失败的重要原因。Sun等[7]研究结果显示上海地区Hp对克拉霉素的耐药率从2000年8.6%上升到2005年9.0%再上升到2009年20.7%。国内另一项研究结果显示北京地区Hp对克拉霉素的耐药率从2000年14.8%上升到2009年65.4%[8]。因此在选择治疗方案前，先检测Hp是否对克拉霉素耐药，对于提高Hp根除率具有重要作用。

近年来国内外学者对Hp 23S rRNA耐药基因的突变进行大量研究发现，Hp对克拉霉素耐药主要与2142和2143位点的核苷酸A突变成G有关，最常见的是A2143G占69.8%，其次是A2142G占11.7%和A2142C占2.6%[9]。李晓芳等[10]对2017年成都地区分离的24株耐克拉霉素的Hp研究显示所有耐药株都在23S rRNA基因功能V区发生了A2143G的突变，突变率为100%。孙婷等[11]对2017年浙江地区分离127株Hp进行23S rRNA基因突变筛查结果显示，主要突变为A2143G，突变频率42.5%（54/127）， 其次为A2142G基因型突变2.4%（3/127）。但是也有研究显示Hp耐药株的遗传学特征存在明显地域差异，因此获得本地区Hp对克拉霉素耐药性的结果，对于临床选择最佳的根除方法极为重要。

本实验采用的荧光PCR熔解曲线法是目前国内首次采用KOD-DNA聚合酶用于PCR来进行Hp检测。KOD-DNA聚合酶来源于超嗜热古菌（Thermococcus kodakaraensis），与目前市场上PCR反应体系常用的Taq DNA聚合酶比较，其耐热性是传统Taq DNA聚合酶的7倍，合成速度是其2.5倍。使用KOD-DNA聚合酶可以在45 min内完成整个PCR，大大缩短了目前传统PCR方法所需要的4～6 h的检测时间，极大提高了检测效率。此外本实验还采用quenching-probe技术设计荧光探针，使探针序列缩短到16 bp左右，在68～70 ℃时就能与靶序列特异退火，更短的序列可降低碱基不匹配的概率，从而提高方法的灵敏度。

本实验通过荧光PCR熔解曲线法和DNA测序法对临床组织标本直接检测Hp对克拉霉素耐药位点突变，探寻两种检测方法对耐克拉霉素Hp之间的符合率，采用荧光PCR熔解曲线法直接对80份胃黏膜组织标本进行检测，其中69份样本Hp阳性，阳性为86.2%。在69份Hp阳性的标本中24例标本存在23S rRNA第2142或2143位点的突变，突变率为34.8%。使用DNA测序方法对23株Hp突变株进行突变位点检测，其中2142位点突变率为0，2143位点突变率为100%，19株为2143位点GG突变型，4株为2143位点AG杂合型，这与梁晓等[12]报道的上海地区Hp克拉霉素耐药株主要以A2143G突变为主（97.1%）结果一致。以DNA测序法与荧光PCR熔解曲线方法对于Hp特异性序列检测结果的一致性（Kappa）为0.779，两者一致性较好；对于Hp23S rRNA第2142或2143位点突变检测结果的一致性（Kappa）为0.829，两者一致性较 好。

综上所述，上海地区克拉霉素耐药Hp菌株基因型以23S rRNA基因的A2143G突变占主导地位，23S rRNA点突变的检测可以为临床分析Hp对克拉霉素的耐药性提供重要的参考依据。荧光PCR熔解曲线法可直接检测胃黏膜活检组织中Hp及其23S rRNA突变基因，该方法耗时短且结果可靠，为临床快速、简便的检测Hp对克拉霉素耐药性提供一种行之有效的解决方案。