大花蕙兰花粉贮藏与离体萌发研究

张晓莹，傅巧娟，赵福康，李春楠，阮若昕

(杭州市农业科学研究院 园艺研究所，浙江 杭州 310024)

随着我国经济的发展和国民收入的增加，人们对兰科植物的兴趣和需求日益提高。我国作为很多重要兰科植物的世界分布中心，拥有丰富的野生兰科植物资源[1-2]，如何充分利用这些兰科植物资源，解决市场需求与兰科植物新优品种缺乏之间的矛盾成为发展我国现代兰花产业的重中之重。中国兰花要走向世界，必须立足育种资源，选择优良亲本，培育出具有自主知识产权的品种，才能在竞争中立于不败之地。

利用大花蕙兰花序较大、花葶长、小花数多且花色艳丽、花期长等优良特性进行杂交兰新优品种的培育具有广阔的研究前景[3]。花粉萌发能力是直接影响兰科植物杂交成功与否的重要因素之一，具有足够数量的有活力的花粉是杂交育种的必要条件。兰科植物花粉活力的研究主要集中在花粉采集时间、花粉活力测定方法筛选等方面[3-5]。本研究在前人的研究基础上，以大花蕙兰为材料，筛选适宜的花粉离体萌发培养基配方；对不同贮藏温度、不同保存时间的大花蕙兰花粉进行离体萌发检测，探寻适宜的花粉保存方法，旨在解决大花蕙兰与其他兰花花期不遇的问题，为兰花杂交育种工作提供参考与借鉴。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试的植物材料为大花蕙兰品种JOIC和KK560，保存于杭州市农业科学研究院连栋温室，常规栽培养护管理。试验于2017年12月到2018年8月进行，在大花蕙兰开花期选择生长健壮且无病虫害的4年生苗为供试植株。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉收集与保存

大花蕙兰开花当日上午9:00采取花粉，冰盒带回实验室，用镊子去除药帽和粘盘装入硫酸纸袋中，置于硅胶干燥器内常温干燥24 h(图1)。将干燥后的花粉分别置于室温(25 ℃)、4 ℃和-20 ℃(培养前24 h置于4 ℃解冻)保存。花粉以2种形式保存，一种为花粉块形式，另一种为人工碾压成粉末状，即花粉粒形式。

1.2.2 培养基筛选与花粉离体培养

大花蕙兰的花粉离体萌发所需时间较长，本研究采用液体培养基进行离体培养。利用鲜花粉进行花粉离体培养的培养基筛选，培养基配方见表1。取各种培养基1 mL于2 mL的EP管中，分别加入4个花粉块或研磨的花粉粒，在人工气候箱中培养，温度为28 ℃，光强为4 800 lx，每隔12 h振荡1次，使花粉粒分散。筛选出的最适培养基用于检测不同保存温度(25、4、-20 ℃)、不同保存时间(7、30、60、120、180、240 d)的花粉萌发率。

1.3 拍照记录与统计分析

用移液器将培养大花蕙兰花粉粒的培养基滴在载玻片上(50 μL)，盖玻片封片，OLYMPUS光学显微镜定期观察花粉萌发情况。培养8 d后统计花粉萌发数，花粉管生长正常且长度大于(等于)花粉粒直径视为有生命力的花粉，每个处理观察5个视野，计数并拍照记录。计算花粉萌发率，萌发率(%)=已萌发的花粉粒数÷花粉粒总数×100。采用Excel软件整理原始数据，SPSS软件进行数据分析。

A，大花蕙兰品种JOIC；B，大花蕙兰品种KK560。A， Cymbidium hybridum JOIC; B， Cymbidium hybridum KK560.图1 大花蕙兰品种JOIC和KK560的花与花粉Fig.1 Flowers and pollens of Cymbidium hybridum JOIC and KK560

表1 大花蕙兰花粉离体培养的培养基配方

Table1Medium formulation forinvitrocultureCymbidiumhybridumpollen

编号No.蔗糖Sucrose/%硼酸Boricacid/%氯化钙Calciumchloride/%MS (含30%蔗糖)MS (Containing30% sucrose)0.5MS (含30%蔗糖)0.5 MS (Containing30% sucrose)萘乙酸NAA/(mg·L-1)1300.010.10002300.030.10003300.050.10004300.010.20005300.030.20006300.050.20007300.010.30008300.030.30009300.050.300010300.01000011300.03000012300.050000133000+001430000+015000+00.516000+01.0170000+0.5180000+1.0

+表示添加MS或 0.5 MS。

+represent adding MS or 0.5 MS.

2 结果与分析

2.1 花粉离体培养的培养基筛选

利用大花蕙兰的新鲜花粉进行培养基的筛选，在供试的18种培养基中，不同大花蕙兰品种的花粉萌发率存在明显差异。同时发现，花粉块在培养液中自然散开，四合花粉粒均保持完整的膜结构，能够萌发；而经过人工研磨的花粉块，经过物理碾压，花粉粒的膜结构遭到破坏，未见膜结构不完整的花粉萌发(图2)。表明大花蕙兰花粉适宜的贮藏形态为花粉块状保存。

A，粒状保存；B，块状保存。A， Preservation with granular morphology; B， Preservation with block morphology.图2 不同保存形式的花粉在培养液中的形态(400×)Fig.2 Morphology of different preserved forms of pollen in culture medium (400×)

大花蕙兰品种JOIC在以0.5 MS为基础添加物的培养液中离体萌发率最高(表2)，培养4 d花粉开始萌发，花粉管萌发过程中能够正常伸长，花粉管平滑且伸展(图3A-F)；但在添加不同浓度NAA的培养液中，花粉的萌发率差异不显著(P>0.05)，说明NAA对大花蕙兰花粉离体萌发没有明显的促进作用。以MS为基础添加物的培养液中，4 d时也能观察到花粉萌发，但是萌发率明显低于0.5 MS培养基，并且大量萌发的花粉出现异常，包括花粉管停止伸长、膨大与卷曲等(图3G-I)；以硼酸和氯化钙为基础添加物的培养基中，花粉可以离体萌发，但萌发率相对较低。大花蕙兰品种KK560的萌发率在以硼酸和氯化钙为基础添加物的培养液中最高(表2)，在以MS和0.5 MS为基础添加物的培养液中相对较低，且出现花粉管膨大、停止伸长的现象。

因此，综合考虑大花蕙兰品种JOIC和KK560的花粉离体萌发情况，确定大花蕙兰品种JOIC花粉离体萌发的最适培养基为14号培养基，配方为0.5 MS+30%蔗糖；大花蕙兰品种KK560花粉离体萌发的最适培养基为4号培养基，配方为0.01%硼酸+0.2%氯化钙+30%蔗糖。

表2 大花蕙兰品种JOIC和KK560花粉在不同培养基中的萌发率

Table2Germination rate ofCymbidiumhybridumJOIC and KK560 pollen in different culture medium

编号No.JOIC萌发率Germination rateof JOIC/%KK560萌发率Germination rateof KK560/%140.86±2.33 def44.85±2.32 ab247.47±2.21 bc45.05±5.24 ab347.15±1.51 c44.37±4.68 b444.34±2.31 cdef53.11±2.10 a544.45±4.52 cdef50.58±5.73 ab646.14±0.95 cde50.96±4.21 ab746.33±3.61 cd49.20±2.18 ab847.23±2.75 c51.29±2.91 ab940.73±1.36 def49.50±2.02 ab1038.26±3.17 f45.82±2.78 ab1139.98±0.81 ef45.23±4.92 ab1238.80±0.94 f47.00±6.10 ab1342.73±3.75 cdef42.72±1.91 b1453.98±2.54 a44.72±3.15 ab1539.92±2.17 ef43.12±3.59 b1642.03±4.70 cdef44.75±1.99 ab1753.65±3.13 ab47.45±4.45 ab1854.22±2.18 a49.74±3.04 ab

数据统计分析使用单向方差分析，数据后面无相同小写字母表示显著差异(P<0.05)。

One-way ANOVA was used for the statistical analysis of data. Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05.

2.2 不同贮藏温度、时间对大花蕙兰花粉离体萌发的影响

将不同贮藏温度、时间保存的花粉接种到最适培养基(JOIC接种到14号培养基，KK560接种到4号培养基)。花粉萌发情况统计结果显示，保存温度相同时，随保存时间延长，花粉离体萌发率均逐渐降低(图4)。室温(25 ℃)保存7 d，萌发率迅速降低，保存30 d，花粉萌发率在10%左右；4 ℃保存随着保存时间延长，花粉离体萌发率持续降低，保存至180 d，花粉基本不能离体萌发；-20 ℃保存至60 d，花粉离体萌发率没有明显降低，此后逐渐降低，保存180 d，部分花粉可以萌发，但萌发率为10%～20%(图4)，并出现中空现象(图5)，保存至240 d，花粉基本不能离体萌发。

保存时间相同时，随保存温度的升高，花粉离体萌发率逐渐降低(图4)。保存7 d，室温(25 ℃)保存的花粉萌发率明显降低，4 ℃和-20 ℃保存的花粉萌发率变化不明显；保存至30 d，室温(25 ℃)保存的花粉基本不能萌发，4 ℃保存的花粉萌发率开始降低，降低幅度较小，-20 ℃保存的花粉萌发率变化不明显；保存至60 d，不同保存温度花粉的萌发率均呈降低趋势，4 ℃保存的花粉降低幅度较大，花粉基本不能萌发；保存至180 d，不同保存温度下尽管仍有部分花粉能够萌发，但萌发率均在10%左右；保存至240 d，不同保存温度下，花粉基本不能萌发(图4)。

3 结论与讨论

大花蕙兰花粉粒外面包裹的膜结构，将花粉粒黏连成花粉块，这减缓了花粉的脱水、复水与萌发速度[6]。液体培养液更有利于兰科植物花粉的离体萌发，王利民等[7]研究表明，大花蕙兰花粉在人工培养基上萌发时间较长，离体培养4 d开始萌发，本研究结果与此相似；海南原产墨兰花粉离体培养需24 h，台湾金线莲离体培养2 d开始萌发。不同种间的兰科植物花粉离体萌发时间存在差异，一方面可能由于自身活力等遗传特性差异，另一方面可能与采集时间和花粉含水量相关[4，7-9]。周桂英等[10]认为，光照可以影响大花惠兰的开花质量，间接影响大花蕙兰花粉的生活力。本研究还对花粉保存形态进行研究，以花粉粒和花粉块2种形式保存的花粉进行离体萌发培养，尽管花粉粒能够更好地干燥和复水，可能因为物理碾压破坏了四合花粉粒的膜结构，导致花粉粒不能萌发。

A，离体培养4 d (400×)；B，离体培养6 d (400×)； C，离体培养8 d (400×)；D，离体培养10 d (400×)； E，离体培养12 d (400×)；F，离体培养14 d (100×)；G，花粉管直接膨大(400×)；H，花粉管伸长后膨大(400×)；I，花粉管扭曲 (400×)。A， In vitro culture for 4 d (400×); B， In vitro culture for 6 d (400×); C， In vitro culture for 8 d (400×); D， In vitro culture for 10 d (400×); E， In vitro culture for 12 d (400×); F， In vitro culture for 14 d (100×); G， The pollen tube bulges directly (400×); H， The pollen tube bulged after elongation (400×); I， Pollen tube twisted (400×).图3 大花蕙兰品种JOIC花粉的离体萌发过程Fig.3 Germination of Cymbidium hybridum JOIC pollen

图4 大花蕙兰品种JOIC(A)和KK560(B)花粉的离体萌发率Fig.4 In vitro germination rate of Cymbidium hybridum JOIC (A) and KK560 (B) pollen

图5 大花蕙兰品种KK560花粉粒中空现象(400×)Fig.5 Empty pollens of Cymbidium hybridum KK560(400×)

兰科植物花粉离体培养的培养条件研究表明，蔗糖、硼酸、钙离子浓度是影响兰花花粉离体萌发的重要因素。蔗糖不仅提供能量，同时起到调整渗透压的作用，浓度过低易发生吸涨现象，浓度过高则易造成原生质体脱水，均会抑制花粉萌发[7-8，11]；硼能促进糖的吸收与代谢，并促进花粉管的伸长生长；Ca2+主要影响花粉萌发速度和花粉管的生长速度，郑宝强等[12]研究结果表明，杂种卡特兰花粉萌发培养过程中H3BO3和CaCl2的浓度过高和过低，都不利于花粉管的萌发和生长。本研究中大花蕙兰品种JOIC和KK560的最适离体萌发培养基也存在较大差异，在不适宜的培养基中萌发率普遍不高且花粉管萌发后很难伸长，与前人的研究结果相似[7]。

不同保存温度和保存时间对花粉活力影响较大，降低保存温度能够延长保存时间。邓茜玫[13]研究表明，石斛兰花粉在4 ℃保存80 d，花粉萌发率下降至0；-20 ℃保存3个月内花粉萌发率均保持在20%以上，可供正常授粉使用。本研究结果表明，大花蕙兰花粉在4 ℃保存30 d后生活力迅速下降，-20 ℃保存能够显著提高保存时间，与卡特兰的相关研究结果相符[12]。本研究发现，随贮藏时间的延长，花粉粒出现中空现象，可能由于花粉内耗导致。因此，建议保存前花粉块硅胶阴干24 h，-20 ℃保存，期限为6个月。