活体成像技术在NK/T细胞淋巴瘤早期检测中的应用价值研究

刘凡，赵玉，潘新宇，付瑶，于建渤*

淋巴瘤是一组来源于血液淋巴系统的恶性肿瘤，是世界范围内十大恶性肿瘤之一，好发于亚洲、墨西哥及南美洲，男女发病比率为（3～4）∶1［1-4]。随着社会发展和肿瘤流行病学因素的变化，淋巴瘤发病年龄已呈现明显年轻化趋势，发病率逐年上升，5年生存率不足50%，成为威胁人类生命的一大杀手［5-6]。因此，探索NK/T细胞淋巴瘤早期诊断的新方法，是进一步提高NK/T细胞淋巴瘤患者生存率的关键［7-9]。

活体肿瘤动态监测是医学研究领域的一项重要内容，自1999年美国哈佛大学WEISSLEDER首次提出分子影像学概念至今，分子影像学在世界范围内取得了长足发展，为精准医学早期诊断疾病提供了有效技术支持［10-11]。光学分子影像学技术能够非侵入性、实时监测、定量分析肿瘤模型中肿块的生长、侵袭、转移，是发展精准医学诊疗的必然方向［12]。

本研究以NK92-Luc裸鼠移植瘤模型为研究对象，以小动物活体成像仪为辅助手段，监测NK/T细胞淋巴瘤动态生长过程，深化活体成像技术（IVIT）在NK/T细胞淋巴瘤早期研究中的应用。

1 材料与方法

1.1 研究材料 NK92-Luc淋巴瘤细胞株由黑龙江省肿瘤重点防治实验室提供；SPF级雌性BALB/C-nu裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；RPMI1640培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司；重组人白介素2（RH IL-2）购自美国R&D公司；嘌呤霉素培养基购自成都思天德生物科技有限公司；萤火虫荧光素酶钾盐D-Luciferin购自美国Xenogen公司；小动物活体成像仪为Berthold Technology-NightOwl LB983；倒置荧光显微镜为尼康TS100-F。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和动物饲养 2015年10月—2016年10月，NK92-Luc细胞培养在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、89%的RPMI1640培养基、1.5 μg/ml嘌呤霉素培养基中，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养。SPF级雌性BALB/C-nu裸鼠，体质量8～15 g，4～6周龄，饲养在SPF级超净层流室，恒温（24～26 ℃）饲养，垫料、笼具、饲料及饮水均经过高压灭菌和紫外线照射处理。

1.2.2 构建裸鼠皮下移植瘤模型 取对数生长期NK92-Luc细胞， 移 入15 ml离心 管离 心（1000 r/min，5 min，r=7 cm），弃上清液，经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，适量PBS重悬，细胞计数板计数，按照1×106个细胞/只接种密度，配置细胞悬液。将裸鼠固定在超净工作台中，75%乙醇溶液消毒裸鼠左侧季肋皮肤，按照每只100 μl NK92-Luc细胞悬液（含1×106个细胞）的剂量，在3只裸鼠左侧季肋皮下接种。实验重复3次，隔天观察裸鼠状态。

1.2.3 常规方法观察肿瘤生长动态 接种NK92-Luc细胞后，每天触摸和目测接种部位，待肿块可触及时记为肿瘤出现时间。本研究中，接种肿瘤细胞第5天裸鼠均出现局部皮肤凸起、增厚，接种肿瘤细胞第5、8、11天用游标卡尺测量肿瘤最长径和垂直方向最大横径，计算瘤体积（体积=横径2×长径/2），绘制肿瘤生长曲线。

1.2.4 小动物活体光学成像技术监测裸鼠肿瘤的生长动态 接种肿瘤细胞第5、8、11天，通过小动物活体光学成像仪检测裸鼠皮下移植瘤的生物发光情况，取3只荷瘤裸鼠（造模和成像监测均为相同的3只裸鼠），腹腔注射50 μl D-Luciferin（1 mg/ml），记录注射荧光素酶底物时间；在注射D-Luciferin第7 分钟时将裸鼠放入麻醉箱中进行异氟烷吸入性麻醉；在注射D-Luciferin第9 分钟时将3只裸鼠整齐放入活体成像仪暗箱平台，调整控制平台升降至合适视野，开启激发光源，采用仪器配备的indigo软件对图像和数据进行分析处理；在注射D-Luciferin第14分钟时获取成像图片。计算各区域发出的光子数，检测发光细胞在活体动物内的灵敏度（参数：曝光时间5 min/次）。

1.2.5 肿瘤肉眼大体观察和苏木素-伊红（HE）组织形态学观察 在实验完毕后，采用断颈法处死裸鼠，剔除肿块，行肉眼观察，并快速用微量天平称重。肿瘤组织切小块，置于10%中性甲醛溶液中，石蜡包埋切片，HE染色，电镜下观察。具体步骤如下：60 ℃烤片40 min；二甲苯脱蜡2次，5 min/次；酒精梯度脱水（依次为100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、85%、75%，各3 min），自来水冲洗；浸入苏木素液染色5 min，自来水冲洗；1%盐酸酒精分化30 s；自来水冲洗，静置显蓝10 min；HE染色3 min，自来水冲洗；酒精梯度脱水（依次为75%、85%、95%、100%Ⅱ、100%Ⅰ，各3 min）；二甲苯透明2次，5 min/次；中性树胶封片。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NK92-Luc细胞培养和形态学观察 在显微镜下，NK92-Luc细胞在培养基中悬浮生长，成簇生长，细胞呈圆形、类圆形（见图1）。

图1 普通显微镜下NK92-Luc淋巴瘤细胞形态Figure 1 Observation of NK92-Luc cell lymphoma morphology under ordinary microscope

图2 裸鼠移植瘤模型肿瘤生长曲线Figure 2 Tumor growth curve of the nude mouse model of subcutaneous xenograft tumor

2.2 常规方法观察肿瘤的生长动态 在接种瘤细胞第5、8、11天肿瘤体积分别为（0.0038±0.0023）、（0.1323±0.0607）、（0.4232±0.0696）mm3； 根据3只裸鼠平均肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，肿瘤体积在前2 d增长不明显，在第3～5天增长明显加快，在第6～8天增长速度最快，在第9～11天增长趋向缓和（见图2）。

2.3 IVIT成像 在接种肿瘤细胞第5天，生物发光成像已经可以检测到裸鼠皮下肿瘤细胞生物发光信号。随着接种时间延长，皮下移植瘤体积及其生物发光信号逐渐增强，肉眼可见每只裸鼠左侧季肋部接种肿瘤细胞部位发出明亮荧光，随着时间变化肿瘤逐渐增大（见图3）。第5、8、11天肿瘤平均实测光子数为（53688222±25446363）、（2072443366±1029688415）、（5559915605±708457376） ph/s；根据小动物活体成像仪成像时生物发光光子数绘制曲线，其与肿瘤生长曲线的变化趋势一致（见图4）。

2.4 剥除肿瘤肉眼大体观察 裸鼠在接种瘤细胞后第4～5天均能成瘤。肿瘤重量为（0.5020±0.0894） g；肉眼观，在裸鼠局部皮下可见移植瘤为圆形或类圆形肿块，剥除肿瘤可见肿瘤外周有纤维组织包绕，切面呈灰红、灰白色，鱼肉状，质嫩较脆，易出血（见图5）。

2.5 HE染色组织形态学观察 HE染色光镜下见肿瘤周围由纤维组织包绕，肿瘤细胞排列成片状或巢状，可见肿瘤细胞浸润血管现象，有不同程度的凝固性坏死；伴不同程度的炎性细胞浸润，如淋巴细胞、浆细胞及嗜酸粒细胞等；瘤细胞大小不一，核型不规则，胞浆中等量，可见病理性核分裂象（见图6A）；肝脏失去正常组织形态，伴随肿瘤细胞浸润（见图6B）。

3 讨论

图3 裸鼠移植瘤模型IVIT成像Figure 3 IVIT imaging of nude mouse model of subcutaneous xenograft tumor

图4 接种肿瘤细胞后不同时间点生物发光光子数曲线Figure 4 Curve of number of bioluminescent photons at different time points after inoculation of tumor cells

图5 肉眼观察3只裸鼠肿瘤形态变化Figure 5 Naked-eye observation of tumor morphological changes in three nude mice

图6 裸鼠肿瘤组织和肝脏病理组织学表现（HE染色，×200）Figure 6 Tumor and liver histopathological findings of the nude mouse

近年来，IVIT在肿瘤发生发展、转移及基因治疗等领域备受研究者关注。与传统肿瘤诊疗技术相比，IVIT具有传统技术不可比拟的优势，能够无创、连续、动态监测肿瘤的生长变化，为研究肿瘤相关的动物实验提供科学依据［13-14]。目前，建立人类裸鼠肿瘤移植瘤模型是现今生物医学转化研究的重要工具，通过模拟人体环境，借助活体生物发光成像系统可直观、连续、敏感地对肿瘤进行动态可视化观察，指导医生制定最适诊疗方案［15-16]。鉴于肿瘤细胞本身无光学特性，因此，通过能发光且可检测的生物源性荧光——Luc基因标记肿瘤细胞，使肿瘤细胞携带可发光的Luc基因，随后将该类具备发光性能的细胞接种于裸鼠皮下，在裸鼠腹腔注射荧光素酶底物后，即可通过小动物活体成像仪中灵敏的CCD相机设备定量检测体内所发射的光子数量并最终转换为人类肉眼可见图像，达到连续动态观测肿瘤生长变化的目的。

本研究首先常规培养NK92-Luc细胞，在显微镜下，可见NK92-Luc细胞在培养基中呈悬浮、成簇状生长，细胞形态为圆形、类圆形，生长情况较好。随后，成功建立裸鼠皮下NK/T细胞淋巴瘤移植瘤模型。这与任苑蓉等［17]用于研究人大细胞肺癌而构建的L9981-Luc研究结果相一致。同时，测量第5天、8天、11天荷瘤裸鼠肿瘤体积，结果表明3只裸鼠肿瘤体积在前2 d增长不明显，在第3～5天肿瘤体积增长明显加快，在第6～8天肿瘤体积增长速度最快，这表明肿瘤细胞进入裸鼠皮下后可迅速扩增。在肿瘤细胞注射至裸鼠皮下第5天，通过小动物活体成像仪观测到肿瘤部位较强的荧光信号，荧光信号越强反映肿瘤细胞数量越多，也代表肿瘤体积越大，结果显示，肿瘤部位荧光信号强度随天数增加而增强。根据小动物活体成像仪成像时生物发光光子数绘制的曲线，与肿瘤生长曲线变化趋势一致，证明本研究使用无创技术，达到了连续示踪裸鼠体内肿瘤变化的目的。这说明小动物活体成像仪可成功监测裸鼠皮下移植瘤模型的演进过程，可为肿瘤体内生长、转移等研究提供无创、定量示踪手段［18-19]。

综上，本研究以NK92-Luc细胞、裸鼠皮下移植瘤模型为研究对象，成功构建NK/T细胞淋巴瘤，通过IVIT动态观测并示踪活体肿瘤，初步探索NK/T细胞淋巴瘤的诊断新方法，具有重要的科学价值和临床意义。