应用Time-lapse研究人3PN胚胎的卵裂模式

史艳彬，马超，余巧巧，邵小光

(大连市妇女儿童医疗中心生殖与遗传医学中心，大连 116000)

受精卵含有三个原核称为3PN(tripronuclear)合子。3PN在体外受精(IVF)胚胎中的发生率是4%～7%，卵胞浆内单精子注射(ICSI)胚胎中的发生率是6%[1]。IVF过程中的3PN胚胎中，80%以上是因为双精入卵导致；而ICSI过程中的3PN胚胎主要是卵母细胞第二次减数分裂失败或第二极体未能排出导致[2]。

以往关于3PN的研究主要集中在染色体[3]，而不是细胞周期的时间动力学。研究发现，在80%以上的IVF 3PN胚胎中可以观察到两对中心粒，而ICSI 3PN胚胎中仅发现一对中心粒[4]。因为第一次有丝分裂被父源性中心粒控制，我们推测IVF 3PN与ICSI 3PN、ICSI 2PN和IVF 2PN的卵裂模式可能存在差别。3PN胚胎的形态学表现与2PN胚胎相同，所以IVF周期中原核过早消失的胚胎因无法明确PN数往往被丢弃。本文通过时差胚胎监测(Time-lapse)培养箱，比较IVF 3PN与ICSI 3PN、ICSI 2PN和IVF 2PN的卵裂模式和胚胎动力学参数，为避免错误地丢弃具有发育潜能的胚胎提供理论依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2017年7月至2018年6月就诊于大连市妇女儿童医疗中心的生殖与遗传医学中心接受辅助生殖技术(ART)助孕并同意将胚胎放置Time-lapse培养箱中培养监测的患者142例。

纳入标准：2PN组胚胎来源于受精卵全部是2PN(本周期没有3PN、1PN、0PN)的患者，3PN组胚胎来源于受精卵至少有一个3PN的患者；年龄≤38周岁；ART次数<3次。排除标准：卵巢功能储备下降；FSH>20 U/L；子宫内膜异位症；PCOS患者；男方严重少弱畸精子症；补救显微受精患者。排除未分裂合子、5细胞以下和碎片>20%的胚胎。

二、研究方法

1.分组：根据受精方式及受精结果分为4组：IVF 2PN组(n=150)、ICSI 2PN组(n=100)、IVF 3PN组(n=132)、ICSI 3PN组(n=11)。

2.IVF和胚胎培养：常规超促排卵、阴道经B超引导下采卵、获得的卵冠丘复合物在培养箱中培养2～6 h后，依据治疗指征给予IVF或ICSI受精。ICSI受精后立即放置Time-lapse三气培养箱中(ESCO Miri-TL，丹麦)连续培养；IVF精卵共培养置于三气培养箱中(Labotect C200，德国)，短时受精推测受精后放置Time-lapse三气培养箱中继续培养。所有胚胎使用一步培养液(global total LP，美国)培养，2PN胚胎培养至D3天移植或冷冻，3PN胚胎培养至八细胞以上。

3.Time-lapse监测和评估：平均每10 min图像被记录一次。对于ICSI胚胎，精子注入卵母细胞的时间定义为t0；对于IVF胚胎，卵母细胞加入调好浓度的精液盘中的时间定义为t0。所有关键时间点和分裂模式在Time-lapse软件系统下被同一观察者定义。记录卵裂模式、原核出现的时间、原核消失的时间、第一次卵裂的时间、t4(从1-细胞分裂成4-细胞的时间)、t3-t5(从3-细胞分裂成5-细胞的时间)。

三、统计学处理

结果

一、各组胚胎卵裂模式比较

IVF 3PN胚胎组79.55%(105/132)直接分裂成4-细胞，18.94%(25/132)直接分裂成3-细胞，0.76%(1/132)直接分裂成5-细胞，0.77%(1/132)直接分裂成6-细胞；IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎组异常分裂模式主要为直接分裂成3-细胞。

统计结果显示：IVF 3PN胚胎分裂成2-细胞比率显著低于其余3组(P<0.001)，IVF 3PN胚胎直接分裂成4-细胞的比例显著高于其余3组(P<0.001)；而IVF 3PN和IVF 2PN胚胎、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎直接分裂成3-细胞比率无显著性差异(P>0.05)(表1)。

二、IVF 3PN胚胎与IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂异常比率比较

IVF 3PN胚胎第一次卵裂模式异常率、在28 h发育到4-细胞的比率以及t3-t5<11 h的胚胎比率均显著高于其余3组(P<0.001)；而IVF 3PN胚胎在23 h发生第一次卵裂的比率显著低于其余3组(P<0.001)(表2)。

三、各组胚胎动力学参数比较

IVF 3PN胚胎原核消失的时间、第一次卵裂时间均显著长于其余3组(P<0.05)； IVF 3PN胚胎分裂成4-细胞的时间(t4)及从3-细胞到5-细胞(t3-t5)的时间均显著短于其余3组(P<0.05)；IVF 2PN、ICSI 3PN和ICSI 2PN之间的卵裂动力参数均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表1 IVF 3PN胚胎与IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂模式比较[n(%)]

注：与IVF 3PN组比较，*P<0.001

表2 IVF 3PN胚胎与IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂异常率比较[n(%)]

注：与IVF 3PN组比较，*P<0.001

表3 各组胚胎的动力学参数比较(-±s)

注：与IVF 3PN组比较，*P<0.05

讨论

部分研究者通过第2天观察IVF 3PN合子有丝分裂的过程发现了部分合子直接分裂成3-细胞的现象。Kola等[5]报道了29个IVF 3PN合子中，18个(62%)直接分裂成3-细胞；Balakier[6]报道了32个IVF 3PN合子中，6个(19%)直接分裂成3-细胞；Pang等[7]报道了32个IVF 3PN合子中，7个(22%)直接分裂成3-细胞。然而，这些报道都是传统的非连续性的胚胎评估。Staessen等[8]报道了ICSI 3PN合子有丝分裂的过程发现：第2天胚胎处于2-细胞或4-细胞阶段，研究还比较了IVF和ICSI 3PN在第2天的细胞数，发现二者没有统计学差异。与既往研究的胚胎培养方式不同，我们使用Time-lapse培养箱发现IVF 3PN中的79.55%(105/132)直接分裂成4-细胞，18.94%(25/132)直接分裂成3-细胞，0.76%(1/132)直接分裂成5-细胞，0.76%(1/132)直接分裂成6-细胞。我们也观察到IVF 3PN分裂成3-细胞比率略高于ICSI 3PN，但无统计学差异(18.94% vs.18.18%，P=0.95)。

中心粒和其周围的基质组成了有丝分裂的纺锤体。1994年，Palermo等[9]研究证明精子的中心粒控制着合子的第1次有丝分裂。二精入卵可能会在合子中形成两对中心粒，如果合子中过度的中心粒不休眠，那么过度的中心粒就有可能使合子卵裂异常：直接分裂成3-细胞[10]。因此，我们推测这就是IVF 3PN直接卵裂成3-细胞以上的发生率要显著高于IVF 2PN、ICSI 2PN和ICSI 3PN的原因。但是在Time-lapse下不能直接观察到中心粒和纺锤体结构，因此不能得到最终的结论。

然而，多余的父源性中心粒影响卵裂的假说却不能解释部分正常2PN和部分ICSI 3PN也可能直接卵裂成3-细胞。 推测可能是卵孤雌激活会形成一个没有中心粒的纺锤体极，再与一个正常的中心粒结合就可能形成第3个纺锤体[11]；也有可能是父源性中心粒在第1个细胞周期的S期发生加倍复制，或者精子中携带两对中心粒[12-13]。目前已经有研究发现2PN胚胎直接卵裂成3-细胞的植入率显著低于正常卵裂模式的胚胎[14]。第3个纺锤体极形成的原因以及如何形成的将有待于进一步研究。

我们还发现IVF 3PN第1个细胞周期显著长于IVF 2PN[(27.06±1.59)h vs.(22.64±1.38)h](P=0.04)。推测可能是相比2PN胚胎，3PN胚胎的有丝分裂纺锤体结构更复杂。因为纺锤体的三级结构，有丝分裂的微管可能在3个位点连接在着丝粒，从而形成异常的“Y”字形赤道板，使得3PN胚胎需要更长的时间发生卵裂。本研究中，尽管ICSI 3PN直接分裂成3-细胞的比例高于ICSI 2PN(18.18% vs.11.00%，P=0.09)，但是ICSI 3PN第1次卵裂的时间与ICSI 2PN相比无统计学差异[(22.32±1.56)h vs.(22.78±1.66)h](P=0.82)。虽然我们的研究数量有限，但是可以推测IVF 3PN与ICSI 3PN异常卵裂的原因不同。ICSI 3PN直接卵裂成3-细胞可能是合子先直接分裂成2-细胞，其中1个卵裂球没有发生DNA和中心粒的复制就迅速发生分裂，并没有形成耗时的“Y”字形赤道板。

受显微镜技术发展的限制，3PN胚胎的发生机制还不清楚：是由于皮质反应缺陷导致双精入卵，还是卵源性/精源性减数分裂错误导致双雌受精/双雄受精?国外学者新开发的显微镜技术——激光层片扫描显微技术(Light sheet Microscopy technology，LSMT)[15]，依赖其高速和空间精度大大减少了胚胎接触的光毒性和光漂白性，并且具有非常高的时间分辨率的特性能够对胚胎发育早期阶段进行实时、3D成像。期待应用该技术可以早日揭示3PN胚胎的发生和异常卵裂的机制。