姜黄素通过TLR4-MAPK/NF-κB信号通路对巨噬细胞极化及炎症反应的影响

唐彪 周瑶瑶

巨噬细胞作为一类具有可塑性、异质性的免疫细胞，根据周围微环境的不同刺激可呈现出一系列不同的表型（主要分为M1型和M2型），即巨噬细胞的极化现象[1-2]。姜黄素是姜黄根中的多酚成分，具有抗氧化、抗炎、抗微生物和抗凋亡等多种药理活性[3-5]。我们之前的研究证实姜黄素可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）联合干扰素γ诱导的巨噬细胞中各种炎症因子的表达[6]。然而，姜黄素是否能影响巨噬细胞的极性及其具体的抗炎机制尚不十分明确[7]。因此，本研究拟通过观察姜黄素对LPS诱导的M1型巨噬细胞的极性及炎症因子表达的影响，进一步研究姜黄素对巨噬细胞TLR4-MAPK/NF-κB信号通路的作用，为姜黄素在免疫调节、抗炎治疗等方面提供一定的理论依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 单核细胞株RAW264.7按照美国典型物培养中心（ATCC）的说明，采用含10%FBS的DMEM培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养。将姜黄素溶于DMSO中制成浓度为100mM的浓缩液，设置不同浓度，分别为 0μmol/L（LPS组）、6.25μmol/L（姜黄素 6.25μmol/L 组）、12.5μmol/L（姜黄素 12.5μmol/L 组）、25μmol/L（姜黄素 25μmol/L组）预处理巨噬细胞2h后加入LPS（1μg/ml）。为研究TLR4-MAPK/NF-κB信号通路在巨噬细胞极化中的作用，将未加入姜黄素的细胞分为对照组、LPS组、vector组、siTLR4组、JNK抑制剂组、ERK 抑制剂组和p38抑制剂组，后4组分别加入siTLR4、JNK抑制剂、ERK抑制剂和p38抑制剂，继续培养24h，收集细胞，用于提取细胞的蛋白质和RNA。

1.2 实验试剂及仪器 实验试剂包括RAW264.7巨噬细胞（中科院上海生化细胞所细胞库）；DMEM高糖培养基及FBS（美国Hyclone公司）；LPS、姜黄素（美国Sigma-Aldrich公司）；抗体（美国Abcam公司）；JNK 抑 制 剂 （SP600125）、ERK 抑 制 剂（SCH772984）及 p38抑制剂（SKepinone-L）（美国Selleck Chemicals公司）；一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗体（美国 CST公司）；CD206抗体（美国Abcam公司）；TRIzol（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（美国MBI Fermentas公司）、Quant qRT-PCR（SYBR Green I）试剂盒（美国TIANGEN公司）；引物由上海生工生物工程有限公司设计合成，其他各种化学试剂均为进口或国产分析纯。实验仪器包括层流超净操作台（无锡一净公司）；LX70倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；低温高速离心机（德国Sigma公司）；超低温冰箱（日本SANYO公司）；恒温CO2培养箱（美国Quene公司）；RNA定量分析仪（美国BIO-RAD公司）；逆转录PCR基因扩增仪（美国Applied Biosystems公司）；Real-Time PCR仪（美国ABI公司）；凝胶成像系统Gel Doc EZ、化学发光成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR（real-time PCR）法检测肿瘤坏死因子α（tumornecrosis factor alpha，TNF-α）及白介素 -6（interleukin-6，IL-6）mRNA 的表达按Trizol说明书提取各组细胞的总RNA，采用紫外分光光度法检测RNA的纯度和浓度，按RT-PCR试剂盒操作步骤将各组mRNA逆转录为cDNA。反应条件如下：65℃ 5min，42℃ 1h，70℃ 5min。同时，通过比对TNF-α及IL-6和内参在Genebank中相应的基因全长cDNA序列分别设计引物，序列如下：TNF-α正向引物TTGCCCTGTGAGGAGGAC，反向引物TGAGCCAGAAGAGGTTGAGG；IL-6正向引物CTTCGGTCCAGTTGCCTTCT，反向引物GTGAGTGGCTGTCTGTGTGG；β-actin 正 向 引 物 CATGTACGTTGCTATCCAGGC，反向引物CTCCTTAATGTCACGCACGAT。使用荧光定量聚合酶链反应仪及Quant qRT-PCR（SYBR Green I）试剂盒，以β-actin为内参，确认扩增曲线和融解曲线，分别得出Ct值，并采用2-ΔΔCt计算TNF-α及IL-6 mRNA的相对表达量。每个实验重复3次。

1.3.2 Western blot法检测 iNOS、CD206 及p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65的总体及磷酸化水平 上述分组的巨噬细胞经处理后，RIPA裂解液裂解细胞并提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定各组样品蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液煮沸备用。蛋白经10%SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，染色洗膜后用脱脂奶粉封闭，结合一抗，室温下摇动1h，4℃孵育过夜。经PBST洗膜后加入HRP标记的二抗，室温孵育1h，再次洗膜后用ECL化学发光显色。结果用凝胶图像处理系统分析目标条带与内参条带的光密度值。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两独立样本间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组巨噬细胞M1型极化及相关炎症因子TNF-α、IL-6的比较 见图1。

图1 各组巨噬细胞M1型极化及相关炎症因子TNF-α、IL-6的比较（A：各组巨噬细胞iNOS及CD206蛋白表达的电泳图；B：各组巨噬细胞iNOS及CD206蛋白表达水平的比较；C：各组巨噬细胞TNF-α mRNA表达水平的比较；D：各组巨噬细胞IL-6 mRNA表达水平的比较；与 LPS 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

由图1可见，与对照组相比，LPS组iNOS和CD206的表达水平均显著升高（P＜0.05），TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平也显著升高（P＜0.05）。与LPS组相比，随着姜黄素干预组中药物浓度的升高，iNOS的表达水平显著降低（P＜0.05或0.01），而CD206的表达水平无明显变化（均P＞0.05）；TNF-α、IL-6 mRNA表达水平下降（P＜0.05或0.01）。

2.2 各组巨噬细胞TLR4及p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65表达水平的比较 见图2。

由图2可见，在LPS的刺激下，TLR4 mRNA的表达水平较对照组显著增加（P＜0.05）；另一方面，随着姜黄素浓度的升高，TLR4 mRNA的表达水平下降（均P＜0.01）。与对照组相比，LPS组p38/ERK/JNK/IκBα/p65的磷酸化水平显著增加（P＜0.01），而总体表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与LPS组相比，姜黄素25μmol/L组可显著抑制LPS引起的TLR4-MAPK/NF-κB通路的激活，具体表现为p38/ERK/JNK/IκBα/p65磷酸化水平的回落（P＜0.05，图2C-D）。

2.3 各组巨噬细胞TNF-α和IL-6表达水平的比较 见图3。

由图3可见，通过siTLR4以及下游通路关键分子的抑制剂分别下调相应分子的表达，从而在不同水平阻断该信号通路的传导，与vector组相比，siTLR4能显著降低其下游蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）；同时，JNK的抑制剂SP600125、ERK的抑制剂SCH772984以及p38的抑制剂Skepinone-L也能分别在不同水平阻断MAPK通路的传导（P＜0.05）（图3A-B）。与vector组相比，siTLR4组巨噬细胞TNF-α和IL-6的表达水平显著降低（均P＜0.01）；另外，JNK的抑制剂 SP600125、ERK的抑制剂SCH772984以及p38的抑制剂Skepinone-L也能显著降低TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平（P＜0.05或0.01，图 3C）。

3 讨论

图2 各组巨噬细胞TLR4及p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65表达水平的比较（A：各组巨噬细胞TLR4蛋白表达的电泳图；B：各组巨噬细胞TLR4蛋白表达水平的比较；C：各组巨噬细胞p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65蛋白表达的电泳图；D：各组巨噬细胞p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65蛋白表达水平的比较；与LPS组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

图3 各组巨噬细胞TNF-α和IL-6表达水平的比较（A：各组巨噬细胞p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p6蛋白表达的电泳图；B：各组巨噬细胞p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p6蛋白水平的比较；C：各组巨噬细胞TNF-α和IL-6 mRNA表达水平的比较；与LPS组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

巨噬细胞作为一群具有可塑性的免疫细胞，可因不同的环境刺激分化为功能各异的亚型[8]。根据不同的细胞特征和功能，巨噬细胞通常被分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞是由LPS和干扰素γ等微生物产物或促炎因子激活的。它们通过产生促炎细胞因子，如IL-1、诱导iNOS和TNF-α等，促进持续的炎症反应并引发组织损伤[9]。另一方面，M2型巨噬细胞是由IL-4或IL-13诱导的，通过分泌各种抗炎因子，起到减轻炎症反应和修复组织的作用[10]。识别这两种巨噬细胞的方式主要依赖于各自的生物标记，如M1型（iNOS，CD11c，MARCO）和 M2 型（Arg1、CD68、CD206）[11]。本文中iNOS和CD206分别作为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的生物学标志。其中，M1型及M2型巨噬细胞分别执行着“破坏”及“修复”的功能[12]。M1型巨噬细胞可通过释放大量的促炎因子引发炎症反应、促进细胞凋亡。M2型巨噬细胞则分泌抗炎因子以减轻过度的炎症反应[13]。因此，通过调控巨噬细胞的极性达到免疫平衡将成为治疗炎症相关疾病的有效手段。

姜黄素作为一种相对安全的植物多酚，具有广泛的药理作用，可用于防治心血管疾病、肿瘤、炎症性肠病、缺血性脑卒中等疾病[14-15]。大量的实验研究表明，姜黄素具有强大的免疫调节及抗炎作用[5，16]。有研究发现，姜黄素可通过增加M2型巨噬细胞、减少M1型巨噬细胞，从而影响巨噬细胞功能，减轻炎症反应[17-19]。本研究显示姜黄素可抑制巨噬细胞向M1型极化，减少巨噬细胞中促炎因子（TNF-α及IL-6）的表达。

本研究通过Western blot方法分别检测p38/ERK/JNK/IKK/IκBα/p65 的总体水平及磷酸化水平，结果提示姜黄素可抑制TLR4-MAPK/NF-κB信号通路的激活，后者被证实参与调控M1型细胞因子（TNF-α及IL-6）的表达。姜黄素可通过作用于多种分子靶点（包括各种蛋白质激酶和转录因子）调控细胞的炎症及免疫反应[20]。TLR4作为一种病原模式识别受体，在巨噬细胞炎症反应的发生、发展中起到至关重要的作用[21]。通常情况下，TLR4可被LPS激活，通过调控下游信号通路促使巨噬细胞向M1型极化，进而引发细胞的炎症反应[22]。本研究也提示LPS能显著激活TLR4及其下游的MAPK以及NF-κB信号通路。NF-κB作为一种广泛存在的转录因子，参与转录各种与炎症和免疫反应相关的基因。最近的研究证实，姜黄素可以通过阻断TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻急性炎症损伤[23-25]。另一项研究表明，姜黄素可通过抑制TLR4的激活、ERK1/2及p38 MAPK的磷酸化、NF-κB的核移位减少炎症介质的过度表达。本研究结果也表明，M1型细胞因子（TNF-α及 IL-6） 的表达依赖于TLR4/MAPK信号通路的激活。

综上所述，姜黄素可通过抑制TLR4-MAPK/NF-κB信号通路的激活，从而抑制巨噬细胞向M1型极化并减少炎症因子TNF-α及IL-6的表达。该结果将为姜黄素在炎症相关疾病防治领域中的应用提供进一步的理论依据。