靶向蛋白质组的研究

张修萍 徐晗 刘彬

摘要：选择和检查方针蛋白有关的信号，疏忽别的无关的信号，因而能够完成对方针蛋白定量的高特异性和高准确性。

前言：

随着FDA批准的新药数量减少，医药研发也经历着生产力的下降。市场力量、需求与竞争使得医药研发越来越具有挑战性。对疾病机制理解的进步表明，可以剖析复杂和多因素系统，以确定可靠、安全和有效的药物。

设计蛋白-蛋白相互作用的特异性抑制剂可以代替PPI网络中高度互联节点的多效抑制剂。这些抑制剂不仅有助于解开互连网络的复杂性，而且可以提供更广泛的药物靶标。

一、靶向蛋白质组相互作用

小分子调节剂

发现与细胞内蛋白质伙伴竞争结合的小分子是一项艰巨的任务。设计抑制PPI的小分子的一个难点与应该被分子覆盖的表面的大小有关，而抑制酶的活性位点一般通过占据酶的功能腔来实现。与酶的活性位点或受体的结合位点相比，PPI通过由蛋白质原子埋藏形成的大界面稳定，达到数千平方埃。除了与表面尺寸竞争的难度之外，PPI界面还代表着多样化和多方面的结合位点，在构建有效的抑制剂方面构成重大挑战。

寻找小分子PPI抑制剂的第二个难题在于缺乏用于筛选靶向激动剂或拮抗剂的简单功能测定技术。在PPI的情况下，必须重新审视高通量筛选（HTS）。已经开发出测量使用反向两种杂交或BRET的相互作用丧失的高通量蜂窝筛选，并且提供仅选择细胞可穿透分子的优点。

由于八十年代蛋白质结合界面能量分析的出现，小分子PPI抑制剂得到了持续有力的发展。通过丙氨酸扫描技术探索在发生结合时不同接触的贡献。这种技术表明，界面残基的一些突变对两个分子的结合亲和力几乎没有影响，另一些突变主要是不稳定效应。在热点位置相互作用的小分子应与同源伴侣的结合形成竞争，而不必覆盖整个相互作用的表面。

作为小分子PPI抑制剂开发的积极步伐，热点位置与蛋白质多重结合位点的位置相关。定义这些位点为蛋白质同源家族表面的残基，它们对应于稳定天然蛋白质协助伙伴的相互作用中起着关键作用的蛋白质的“粘性区”，并且易于结合小分子。最新的研究显示这些粘性区域富集了抑制剂结合能，为合理选择结合分子开拓了新的思路。

在较大的蛋白蛋白界面中，热点可以在界面上分布得更多，其间距相当大。它们涵盖了更复杂的化学功能组合，增加了发现所有热点抑制剂的难度。PPI抑制剂显示出比传统药物更大的尺寸和分子量。PPI抑制剂也更具疏水性，它们含有更多数量的氢键和至少四个环。这种与经典特征的偏离指出了组合专用于PPI筛选的分子库的必要性，其含有比传统药物设计的化合物库更高的化学多样性和更大的复杂性。对天然产物的进一步探索通常应该有助于多样化和补充这类化合物。用于搜索PPI抑制剂的计算工具也与实验筛选相结合，以加速筛选和降低成本。

化合物库组合的另一种方法称作“片段方法”。它不是选择分子量相对较高的起始分子，而是对一个伙伴进行一组简单的低亲和力小分子片段搜索，并通过基于结构的策略逐步建立抑制剂。对于该策略，结合热点的确定对于定义分子可以有效结合与同源伙伴竞争的关键位置特别有用。在前期的筛选中采用X射线或NMR技术直接进行基于结构的筛选取得成功。可以基于其结合位点直接选择起始分子。即使起始化合物的亲合力落在毫摩尔范围内，通过扩大分子大小同时优化结合亲和力来优化已经足够。也可以使用晶体接触来找到新的结合位点，并通过连接片段增加分子的大小。选择第一个片段的另一个成功的策略是通过SS键在接近靶向PPI相互作用的位置上束缚分子。在该策略中，靶标和初始片段化合物之间共价键的存在有助于获得复合物的结构。

蛋白调节剂：

在这一领域计算方法也做出了重大贡献。建模和设计工具，如Rosetta已经达到了足够的准确性以便能够指导结合剂的合理设计。将合理的设计策略与最先进的显示技术相结合，为结合剂类的多样化打开了很大的视角。计算方法也可用于设计降低蛋白的免疫原性。设计用于抑制PPI的天然、工程或人造抗体通常被认为与同源伙伴竞争;但在少数情况下，他们也通过变构机制发挥效应。然而，由于蛋白质构象的微妙变化，后一种效应机制难以合理化或预测。最后，选择用于紧密结合靶標的抗体、纳米抗体和其他蛋白质的主要限制仍然是这些蛋白质进入细胞的困难。它们的应用主要限于细胞外靶标。

肽和肽拟似物：

肽是足够大的天然化合物，可能阻碍PPI相互作用和命中几个热点。然而，靶向细胞内PPI时，肽抑制剂必须跨过细胞膜。目前细胞穿透肽（CPPs）方面取得了重大进展，这为细胞内肽样药物的发展带来了显着进步。特定肽序列穿透细胞的能力首先在神经递质和病毒蛋白的小蛋白中发现。然后深入研究渗透机制，突出显示各种机制，具体取决于仍在研究中的CPP类型。进入细胞涉及内吞吸收，但也可直接穿越膜。

二、靶向蛋白质组技能：

蛋白质是生命活动的直接执行者，生物学研讨离不开剖析蛋白质的构成及含量改变。如今研讨样本中蛋白质的含量都是直接办法：

1.根据抗体的检查办法，如Western blotting、ELISA。这些办法的可靠性、灵敏度十分依赖于抗体的质量。对那些没有商业化的抗体的蛋白而言，无法用这些办法剖析蛋白含量改变。

2.经过基因表达的改变预测蛋白质含量改变，可是mRNA和蛋白含量之间有关性并不强，致使成果经常出现偏差。那么，有没有一种办法无需经过抗体、或许转录水平这些直接的办法，而是能够之间剖析样品中的含量呢？答案是必定的，这种办法即是咱们要介绍的蛋白质组技能。依照试验意图能够将蛋白质组技能分为两大类：高通量蛋白质组学和靶向蛋白质组学，别离用于前期的区别蛋白挑选以及后续的方针蛋白验证。例如关于临床Biomarker的挑选，通常是首先应从有限数意图临床样本中运用高通量的办法挑选出区别的方针蛋白，然后运用靶向蛋白组技能关于方针蛋白进行扩展样本的验证

靶向蛋白质组技能首要包含SRM/MRM和PRM两种办法。SRM/MRM （Selected/ Multiple reaction monitoring）运用的是三重四级杆的质谱，使用四级杆高选择性的特色对母离子和子离子依次进行分选，该技能在2012年的在Nature Methods中有具体的总结论说1，并被评为年度技能（Method of the Year 2012），可见其重要意义和使用价值。在SRM/MRM的基础上，2012年晚些时候，在MCP上报导了新式的靶向蛋白组技能——PRM（Parallel reaction monitoring）技能2，该技能联系了四级杆的高选择性以及Orbitrap的高分辩、高精度特性，能够对二级图谱进行独立的判定，办法流程愈加快捷。与传统的SRM/MRM对比，PRM在杂乱布景下具有更优异的抗干扰才能和检查灵敏度。因而，PRM是更具优势和潜力的新式靶向蛋白质组检查办法，堪称SRM/MRM的升级版。

总结：

考虑到寻找PPI抑制剂，需要扩大化学空间以有效筛选小分子，并且应该优先聚集专门的化合物库，也可以选择核酸适配子结合蛋白质表面并抑制蛋白质相互作用。设计广泛的肽模拟物的开发工作仍在进行中，应增加有助于靶向PPI的分子化学空间，这种分子的主要障碍可能是免疫反应。最后，如果干扰PPI的研究不断取得进展，那么能够恢复由致病突变引起的PPI损失的分子仍然限于特殊情况。这种分子在开发遗传性疾病中的新药物将是非常有意义的，这可能是该领域即将到来的重要挑战。