miR-146a 基因rs2910164 位点基因多态性与慢性阻塞性肺疾病风险相关性

顾桂芳 丁月平

慢性阻塞性肺病（COPD）是一种进行性疾病，其中慢性中性粒细胞炎症的发生与肺实质（肺气肿）和小气道疾病的破坏有关，导致气流受限和肺功能下降[1-2]。吸入有害物质如香烟烟雾等是COPD 发生的常见危险因素，然而并不是所有的吸烟者都会患COPD，表明COPD 的发生具有遗传性[3]。miRNAs 是由大约19-25 个核苷酸组成的小型非编码RNA，通过增加mRNA 的降解或抑制特定mRNA 的蛋白翻译而导致转录后基因的抑制。它们参与各种生物过程，其表达的改变可能导致病理状况，如肺疾病[4]。本研究的主要目的是分析miR-146a 基因rs2910164位点单核苷酸多态性与血浆中miR-146a-5p 表达水平相关性对COPD 发生风险的影响，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014 年5 月—2017 年10 月期间浙江省绍兴市上虞人民医院和浙江中医药大学附属第二医院呼吸内科收治的145 例COPD 患者作为研究组。从浙江省绍兴市上虞人民医院和浙江中医药大学附属第二医院招募145 名健康体检者作为对照组。本研究方案经医院伦理委员会审核通过，与所有受试者均签署知情同意书。

1.2 纳入、排除标准 纳入标准：（1）均符合中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制定的COPD 诊治指南（2007 年修订版）中COPD 诊断标准[5]；（2）患者相互之间无血缘关系；（3）第一秒钟用力呼气量占用力肺活量比值（FEV1/FVC）＜70%，并且吸入支气管舒张剂后FEV1/FVC 仍＜70%。排除标准：（1）患有支气管扩张、结节病、肺间质纤维化、肺结核、支气管哮喘、糖尿病、心脏病等疾病；（2）肿瘤患者。

1.3 基因型检测 所有受试者均取5mL 静脉血，分离血浆后血细胞用于基因组DNA 提取，血浆保存于-80℃冰箱。血细胞中提取基因组DNA 使用的试剂盒来自天根生化科技（北京）有限公司，批号2014040301。设计miR-146a 基因rs2910164 位点PCR 扩增正向引物序列为5’-GAGGGGTCTTTGCACCATCT-3’；反向序列为5’-CAAGCCCACGATGACAGAGA-3’。以提取的受试者基因组DNA 作为模板，使用生工生物工程（上海）股份有限公司生成的PCR 试剂盒进行PCR 扩增，批号2014110538。PCR扩增后将PCR 产物取10μL 进行商业化测序，供应商为生工生物工程（上海）股份有限公司，测序结果使用Chromas 软件进行分析，本研究中miR-146a 基因rs2910164 位点不同基因型测序结果见图1。

图1 rs2910164 位点不同基因型测序结果

1.4 血浆miR-146a-5p 表达水平检测 进行RNA提取和实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测血浆miR-146a-5p 表达水平。使用Tri Reagent（Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，USA）根据制造商的说明提取总RNA，使用RevertAid TM 逆转录酶试剂盒（K1622，批号2014091302，Fermentas，MA，USA）从总RNA 合成cDNA。使用特异性引物[6]和Maxima TM SYBR Green qPCR Master Mix（K0222，批 号20131205043，Fermentas）进行PCR 扩增，U6 用作miR-146a-5p 表达正常化的内部对照，检测miR-146a-5p 相对U6 的表达水平。

1.5 血浆IL-8 水平检测 使用人IL-8 ELISA 试剂盒（Abcam，货号ab46032，批号2014061304）检测血浆中IL-8 细胞因子检测水平。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行，每个样本做3 个复孔。

1.6 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件。计数资料以率（%）表示，使用χ2检验分析组间差异。计量资料的表示方法为均数±标准差（±s），使用t 检验和单因素方差分析组间差异。使用非条件Logistic 回归模型估计比值比（OR）和95%置信区间（CI）。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 研究组中男86 例，女59例；年龄38～75 岁，平均（56.45±10.85）岁；平均体质指数（BMI）（23.54±2.34）kg/m2。对照组中男88 例，女57 例；年龄40～77 岁，平均（58.31±12.24）岁；平均BMI（23.61±2.54）kg/m2。研究组与对照组年龄、性别、BMI 等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 两组miR-146a 基因rs2910164 位点单核苷酸多态性与COPD 风险相关性 研究组和对照组miR-146a 基因rs2910164 位点基因型频率之间的差异有统计学意义（χ2=15.52，P＜0.01）。以野生型（CC）为标准，杂合子（CG）和纯合子（GG）均是COPD 的危险因素（OR=2.40，95%CI=1.42～4.07；OR=3.27，95%CI=1.27～8.57，P=0.01），显性模型（CG+GG）下COPD风险较高（OR=2.53，95%CI=1.54～4.19，P＜0.001）；隐性模型下患COPD 的风险较低（P=0.07）。以miR-146a 基因rs2910164 位点C 等位基因为参考，突变型等位基因G 是COPD 的高风险因素（OR=1.99，95%CI=1.37～2.89，P＜0.001），见表1。

2.3 两组血浆miR-146a-5p、IL-8 水平 研究组患者血浆miR-146a-5p 水平显著低于对照组，血浆IL-8 细胞因子水平显著高于对照组，差异均有统计学意义（t=14.74，P＜0.01；t=23.67，P＜0.001），见表2。

2.4 不同基因型受试者血浆miR-146a-5p、IL-8 水平比较 野生型（CC）受试者血浆miR-146a-5p 水平显著高于杂合子（CG），纯合子（GG）最低，差异有统计学意义（F=16.75，P＜0.01），而野生型（CC）受试者血浆IL-8 细胞因子水平显著低于杂合子（CG），纯合子（GG）最高，差异也有统计学意义（F=19.37，P＜0.001），见表3。

表1 两组miR-146a 基因rs2910164 位点基因型和等位基因频率比较（±s）[例（%）]

表1 两组miR-146a 基因rs2910164 位点基因型和等位基因频率比较（±s）[例（%）]

注：OR：比值比；CI：置信区间：CC：野生型；CG：杂合子；GG：纯合子；研究组：慢性阻塞性肺疾病患者；对照组：健康体检者

表2 两组血浆miR-146a-5p、IL-8 水平比较（±s）

表2 两组血浆miR-146a-5p、IL-8 水平比较（±s）

注：REL：相对表达水平；IL-8：白介素-8；研究组：慢性阻塞性肺疾病患者；对照组：健康体检者

表3 不同基因型受试者血浆miR-146a-5p、IL-8 水平比较（±s）

表3 不同基因型受试者血浆miR-146a-5p、IL-8 水平比较（±s）

注：REL：相对表达水平；IL-8：白介素-8；CC：野生型；CG：杂合子；GG：纯合子；研究组：慢性阻塞性肺疾病患者；对照组：健康体检者

2.5 血浆miR-146a-5p 水平与IL-8 细胞因子相关性 相关性分析结果显示，血浆miR-146a-5p 表达水平与IL-8 细胞因子水平之间呈负相关性（r=-0.63，P＜0.001），见图2。

3 讨论

图2 血浆miR-146a-5p 水平与IL-8 细胞因子相关性（n=145）注：IL-8：白介素-8

miRNA 是一类丰富的19～25 个核苷酸长左右的非蛋白质编码RNA，通过与靶基因信使RNA（mRNA）的3'非翻译区（UTR）结合调节大约三分之一的蛋白质的编码基因，导致翻译抑制或mRNA 降解[7-8]。据报道，miR-146a 前体中的多态性（rs2910164）与多种恶性肿瘤有关[9-10]。rs2910164 位点C 等位基因位于前miR-146a 过客链上第一个核苷酸约60 个碱基的位置，计算机会预测导致成熟发夹内的错配。本研究结果显示，miR-146a 基因rs2910164 位点野生型（CC）受试者血浆miR-146a-5p 水平显著高于突变型，这种差异至少部分归因于研究人群的不同遗传背景[11]。有学者研究miR-146a-5p 在COPD 气道上皮和肺成纤维细胞之间异常IL-1α 信号传导中的作用，结果显示原代人肺成纤维细胞与气道上皮细胞共培养显著增加miR-146a-5p 的表达，其完全依赖于上皮衍生的IL-1α[12]。miR-146a-5p 表达具有抗炎作用，通过下调IL-1 途径下游的白细胞介素-1 受体相关激酶1（IRAK-1）的表达，并随后减少肺成纤维细胞的IL-8 释放。本研究结果显示，COPD 患者血浆miR-146a-5p 水平显著低于对照组，且血浆IL-8 水平显著高于对照组，另外分析血浆miR-146a-5p 水平与IL-8 细胞因子水平结果显示，血浆miR-146a-5p 表达水平与IL-8 细胞因子水平之间呈负相关性，与Osei 等[11]研究结果一致。从本研究结果来看，携带rs2910164 位点G 等位基因的人群具有较高的COPD 风险，分析原因笔者认为miR-146a-5p 的诱导在COPD 成纤维细胞中显著减少，通过负反馈调节导致IL-8 的释放增加，而IL-8 在COPD 气道炎症的发生和发展过程中具有重要作用[12]。

本研究仍有不足之处，首先样本量较小，没有就不同COPD 严重程度与miR-146a 基因rs2910164位点单核苷酸多态性的相关性进行分析；其次，未能结合环境因素的影响进行分析，忽略了环境因素的影响。