囊袋阻滞综合征患者囊袋内积聚液体及后发性白内障囊膜的蛋白质组成分析△

白宏英 王宁 王朝 刘平 苏胜

囊袋阻滞综合征(capsular block syndrome，CBS)是白内障超声乳化手术一种少见的并发症[1-2]，由于连续环形撕囊的撕囊口被人工晶状体光学部阻塞，使人工晶状体和后囊之间液体积聚，囊袋扩张，进而可能引起近视漂移、前房变浅、继发性青光眼等合并症。CBS根据发生时间不同分为术中、术后早期和术后晚期(术后2个月以后)[3]。术后晚期CBS发生的平均时间是3.8 a，囊袋内积聚的液体通常为乳白色，Vélez 等[4]和Eifrig[5]研究显示，其富含高浓度的α-晶状体蛋白和相对低浓度的白蛋白。对于术后早期CBS，囊袋内积聚液体的蛋白质成分尚不清楚。本研究收集5例术后早期CBS患者，合并后发性白内障和继发性青光眼，通过液相色谱串联质谱鉴定囊袋内积液和后发性白内障囊膜的蛋白质组成，并与晶状体皮质和上皮细胞的蛋白质组成比较，探索它们的相似程度。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2016年7月至2018年6月来我院就诊的术后早期(术后2个月内)CBS患者，人工晶状体和后囊之间大量液体积聚，人工晶状体前移引起近视漂移，其中5例前房变浅，合并后发性白内障以及继发性青光眼(眼压 > 50 mmHg；1 kPa=7.5 mmHg)，如图1示，且药物不能充分散大瞳孔行前囊激光，囊袋内积聚液体过多激光无法准确聚焦后囊或者高度怀疑合并房水逆流和(或)房角明显关闭、粘连，行手术治疗。

图1 CBS患者眼前节分析图像。A：晶状体和后囊之间大量积液，人工晶状体前移，中周部虹膜与角膜相贴；B：对侧眼眼前节分析；C：CBS眼裂隙灯显微镜图像，前房浅，后囊膜混浊

1.2 主要试剂与仪器硫脲、尿素、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)均购自美国Sigma公司；测序级胰蛋白酶(美国Promega公司)。超声波细胞粉碎机(宁波新芝)；液相色谱串联质谱系统(美国Thermo公司)；Pentacam眼前节分析系统(德国Oculus公司)；裂隙灯眼前节照相系统(日本Canon公司)

1.3 方法

1.3.1 样品制备后发性白内障囊膜液氮研磨后，混合低温浓缩的囊袋积液，溶于1 mL强裂解液(7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、30 mmol·L-1Tris、65 mmol·L-1CHAPS)提取蛋白质[6]，冰上裂解40 min，4 ℃离心40 min(20 000 r·min-1)，吸取上清，即蛋白样品。采用Bradford法测定蛋白质浓度，对5份样品进行等量混合，进行后续检测。5例同龄白内障患者晶状体皮质以及前囊膜的上皮细胞收集后，也进行上述蛋白质样品制备及后续质谱分析。

1.3.2 液相色谱串联质谱分析蛋白样品经过还原、烷基化、酶切、冻干处理后，加入测序级胰蛋白酶，37 ℃水浴酶解15 h。所得肽段溶液冻干，-20 ℃保存备用。液相色谱串联质谱分析是通过配有高效液相色谱的LTQ 质谱仪实现的。具体流程和参数参考文献[7-8]。将质谱数据使用Mascot 法搜索人类蛋白质数据库(IPI_Human)，确定每份样品的蛋白质组成。在Mascot 搜索的数据，蛋白质混合物中每个鉴定出来的蛋白对应一个emPAI (exponentially modified protein abundance index) 数据，这个指数与该蛋白在混合物中的相对含量成正比[9]。根据emPAI 数据，估算蛋白样品各组分的相对含量。根据Uniprot数据库检索蛋白质的功能。

2 结果

2.1 手术情况CBS患者基本信息见表1。术中吸出晶状体和后囊之间积液，撕除并收集后囊中心约2.0 mm后发性白内障囊膜，玻璃体切割刀修整切除瞳孔区残余后发性白内障囊膜和前段玻璃体，分离周边虹膜的前粘连，打开房角，所有患者术后第1天前房明显加深，中心部(瞳孔区)后发性白内障囊膜清除(图2)，房角重新开放，术眼眼压恢复至正常范围内，近视漂移(等效球镜)显著降低[术前为(-4.00±1.03)D，术后为(-0.22±0.91)D；P<0.01]，裸眼视力显著提高[术前为(1.66±0.51)logMAR，术后为(0.40±0.22)logMAR；P<0.01)。

2.2 液相色谱串联质谱分析结果对晶状体和后囊之间积聚的液体及后发性白内障囊膜进行液相色谱串联质谱分析，共鉴定出超过60种可信蛋白(检测到特征性的肽段序列)，根据Mascot 搜索的数据估算各蛋白质成分的相对含量，前10位主要成分见表2，含量最多的为αA-晶状体蛋白。根据Uniprot数据库检索的各蛋白成分的功能进行分类：αA-晶状体蛋白、βB1-晶状体蛋白、αB-晶状体蛋白属于晶状体蛋白，其中αA-晶状体蛋白和αB-晶状体蛋白还属于分子伴侣；晶纤蛋白、肌动蛋白、波形蛋白、锚蛋白2属于细胞骨架；三磷酸甘油醛脱氢酶、促进性葡萄糖转运蛋白是葡萄糖代谢相关蛋白；热休克蛋白A5属于热休克蛋白家族，也是分子伴侣。

同龄白内障患者晶状体皮质以及前囊膜的上皮细胞液相色谱串联质谱分析结果显示：晶状体皮质含量最多的有15种蛋白，主要包含各种晶状体蛋白，其中βB1-晶状体蛋白、αA-晶状体蛋白、αB-晶状体蛋白在囊袋内积聚液体和后发性白内障囊膜中的相对含量也较多；晶状体上皮细胞中前15位相对含量较多的蛋白质种类繁多，含量最多的αA-晶状体蛋白、αB-晶状体蛋白、波形蛋白、肌动蛋白、三磷酸甘油醛脱氢酶在囊袋内积聚液体和后发性白内障囊膜中含量也较多。因此，CBS积聚液体和后发性白内障囊膜蛋白成分和晶状体前囊膜上皮细胞中蛋白质组成更为相似。见表3。

表1 CBS患者基本信息

病例年龄性别人工晶状体类型全身合并症房角情况156男双襻丙烯酸酯无全周关闭268女双襻亲水性丙烯酸高血压全周关闭359女双襻丙烯酸酯无全周关闭453女双襻亲水性丙烯酸无窄IV563男四襻亲水性丙烯酸无全周关闭

图2 CBS术后裂隙灯显微镜图像。A：中心部后囊混浊切除；B：前房加深

表2 CBS囊袋内积聚液体以及后发性白内障囊膜的蛋白质鉴定信息

基因名称蛋白质登记号相对分子质量肽段序列∗分数/分#CRYAAαA-晶状体蛋白IPI0002106220 011K.IQTGLDATHAER.A104BFSP1晶纤蛋白IPI0003028274 784R.LQLEAQFLQDDISAAK.D94ACTG1肌动蛋白IPI0002144042 108K.DLYANTVLSGGTTMYPGIADR.M86GAPDH三磷酸甘油醛脱氢酶IPI0079525736 197K.LISWYDNEFGYSNR.V88VIM波形蛋白IPI0041847153 676R.LLQDSVDFSLADAINTEFK.N98CRYBB1βB1-晶状体蛋白IPI0021609228 063R.RAEFSGECSNLADR.G102CRYABαB-晶状体蛋白IPI0002136920 146R.IPADVDPLTITSSLSSDGVLTVNGPR.K96ANK2锚蛋白2IPI0038492863 721K.TEGDSSATALFPQTHK.E98HSPA5热休克蛋白A5IPI0000336272 492K.KSDIDEIVLVGGSTR.I100SLC2A1促进性葡萄糖转运蛋白IPI0022019454 391R.TFDEIASGFR.Q81

注：*鉴定肽段的氨基酸序列。#鉴定出肽段的最高得分，超过40分提示具有特征性

表3 晶状体皮质和前囊膜上皮细胞蛋白质鉴定信息

晶状体皮质基因名称蛋白质前囊膜上皮细胞基因名称蛋白质CRYBB1βB1-晶状体蛋白CRYAAαA-晶状体蛋白CRYBA4βA4-晶状体蛋白CRYABαB-晶状体蛋白CRYAAαA-晶状体蛋白VIM波形蛋白CRYBA1βA1-晶状体蛋白CRYBB2βB2-晶状体蛋白CRYBA3βA3-晶状体蛋白ENO1α-烯醇化酶CRYABαB-晶状体蛋白NCL核仁素CRYBB2βB2-晶状体蛋白FLNA细丝蛋白ACRYGSγS-晶状体蛋白HS90B热休克蛋白90BCRYBB3βB3-晶状体蛋白ACTG1肌动蛋白CRYBA2βA2-晶状体蛋白GAPDH三磷酸甘油醛脱氢酶CRYGCγC-晶状体蛋白MYH9肌球蛋白9CRYGDγD-晶状体蛋白PKM2丙酮酸激酶同工酶M1/M2ENO1α-烯醇化酶HSPA8热休克蛋白A8SPTAN1α-收缩蛋白ANXA2膜联蛋白A2HSPA8热休克蛋白A8PLEC网蛋白

3 讨论

术后晚期CBS囊袋内积聚的液体通常为乳白色[10]，富含大量的α-晶状体蛋白，由此研究者推测这些液体起源于晶状体上皮细胞[5]。然而这样的推论存在2个问题：(1)晶状体皮质同样存在大量的α-晶状体蛋白，这些晚期CBS患者不能排除白内障术中少量皮质残留的影响；(2)由于晚期CBS患者(乳白色液体)α-晶状体蛋白含量过高，会掩盖其他蛋白质，导致其他蛋白质很难被鉴定出来，仅依靠α-晶状体蛋白的推测则其依据不足。而术后CBS早期的液体成分对于推测它们的来源显得更有依据。囊袋内积聚的液体呈透明或者半透明，蛋白质含量相对较少，鉴定结果很可能不易被某几种高丰度蛋白质掩盖，而且由于液体相对透明，有利于显微镜下判断皮质是否明显残留。大部分术后早期CBS患者可行激光治疗[11]，无法采集样品，因此本研究选取合并继发性青光眼，激光无法准确聚焦后囊或者高度怀疑合并房水逆流和(或)房角明显关闭、粘连的患者，手术治疗过程中收集样品进行分析。另外，积聚液体成分及颜色的变化可能与后发性白内障囊膜关系密切，本研究一起取材进行液相色谱串联质谱分析。

本研究的患者都存在前囊撕囊口较小(< 5.1 mm)和后发性白内障。白内障手术后晶状体上皮细胞和皮质细胞会发生转化和增殖[12]，这可能引起后发性白内障以及封闭前囊和晶状体之间的间隙导致囊袋口阻塞。这些转化、增殖后的细胞也能导致混浊液体的释放，蓄积在晶状体和后囊之间导致囊袋扩张，继而引起晶状体前移、房角关闭[13]。另外，手术引起的血-房水屏障破坏导致不同分子、生长因子、激素以及各种细胞在囊袋内沉积以及后发性白内障[14]。随着时间的延长，蓄积的液体在晚期CBS患者可变为乳白色。

本研究中CBS患者囊袋内积聚液体和后发性白内障囊膜主要蛋白质成分有5种(αA-晶状体蛋白、αB-晶状体蛋白、波形蛋白、肌动蛋白、三磷酸甘油醛脱氢酶)，在晶状体上皮细胞中含量也较多，与皮质主要成分相同的只有3种。而且αA-晶状体蛋白在CBS患者和晶状体上皮细胞内含量都最多。因此，CBS积聚液体和后发性白内障囊膜主要蛋白成分与晶状体上皮细胞相似程度更高。CBS患者中另外一种主要晶状体蛋白(βB1-晶状体蛋白)是皮质(纤维)细胞的主要成分，而不在上皮细胞主要蛋白成分之列，提示这些积聚的液体以及后发性白内障囊膜成分可能有少部分来自皮质(纤维)细胞。除了晶状体蛋白，CBS蓄积液体和后发性白内障主要蛋白质成分还包含4种细胞骨架蛋白：晶纤蛋白、肌动蛋白、波形蛋白、锚蛋白2。电镜观察上皮细胞可发生变性，包括上皮细胞浆内大量空泡形成、线粒体肿胀、细胞核呈气球样突起、胞浆内容物丢失，最终只剩肿胀的细胞骨架[15]；而晶状体纤维变性表现为晶状体纤维物质的乳化、高密度颗粒状物进入细胞间隙，最终纤维断裂、皮质崩解。因此，这些细胞骨架蛋白可能部分来自转化、增殖、变性的晶状体上皮、纤维细胞，随着这些变性细胞的不断死亡、释放蛋白质，CBS囊袋内积液蛋白质浓度也不断增高，以致晚期呈乳白色。

CBS积液及后发性白内障囊膜成分中包含两种糖代谢相关蛋白：三磷酸甘油醛脱氢酶和促进性葡萄糖转运蛋白。这两种蛋白含量较高，提示在CBS发生过程中葡萄糖代谢可能比较旺盛；而另外一种热休克蛋白A5，以及αA-晶状体蛋白、αB-晶状体蛋白都属于分子伴侣，它们的高含量说明，在此过程中可能涉及大量错误折叠的蛋白质需要修复[16]。

另外，本研究所选取的患者(继发青光眼)不一定能代表其他早期CBS(未合并青光眼和后发性白内障)患者的蛋白质组成。通常CBS患者的白内障手术过程无从考究，比如是否残留少量皮质等，这会造成CBS积液成分出现较大的个体差异，本研究选取患者的过程中也只能由经验丰富的医师尽可能地排除皮质残留的患者。再者，在合并后发性白内障尤其青光眼的病理情况下，晶状体皮质细胞、上皮细胞这些代谢相对活跃的细胞所分泌蛋白质的种类和量可能都发生了变化，本研究的结果也只能代表这种情境下的蛋白质组成，含量比较多的结构性蛋白(如晶状体蛋白以及细胞骨架蛋白)对于没有其他合并症的CBS患者可能有一定参考意义，需要后续研究证实。

致谢：感谢北京蛋白质组研究中心陈硕在质谱数据分析方面的帮助!