右美托咪定预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤中内质网应激及凋亡的影响

陈亚华，陈 慧，陈玉姣，殷存芝，杨再群

(1.遵义医科大学附属医院 麻醉科，贵州 遵义 563099；2.川北医学院附属医院 麻醉科，四川 南充 637000；3.遵义医科大学第二附属医院 重症医学科，贵州 遵义 563000)

心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)是阻碍缺血心肌获得有效再灌注治疗的最大难题[1]。细胞凋亡是MIRI的主要原因之一，抗凋亡被认为是减轻MIRI的重要手段。右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)是一种具有高选择性α2-肾上腺素能受体的激动药。研究[2]证实DEX能够减轻MIRI并抑制心肌细胞凋亡，但是否与抑制过度内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)诱导的凋亡及其作用机制仍未被阐明。本研究观察大鼠心肌缺血再灌注时，DEX预处理对ERS及相关凋亡途径的影响，探讨DEX在心肌保护中抗凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选购于长沙天勤生物公司实验动物中心，60只SPF级健康雄性SD大鼠(周龄8～10周，体质量260～280 g)，许可编号：SCXK(湘)2014-0011。

1.1.2 主要试剂 右美托咪定注射液(江苏恒瑞股份有限公司)；原位细胞凋亡试剂盒(北京百奥思科生物技术有限公司)：小鼠抗CHOP单克隆抗体、 小鼠抗GRP78单克隆抗体、小鼠抗Caspase12单克隆抗体、Goat荧光二抗(美国Abacam公司)；小鼠抗大鼠GAPDH(美国Sigma公司)； cTnI ELISA试剂盒(美国Abi-英杰公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 实验动物按照随机数字表法分为5组(n=12)：对照组(CON组)、 右美托咪定预处理组(DEX组)、 育亨宾处理组(YOH组)、 右美托咪定预处理+育亨兵处理组(DEX+YOH组)，缺血再灌注组(I/R组)，每组12只。

1.2.2 心肌缺血/再灌注模型的制备 SD大鼠经1%戊巴比妥钠(腹腔注射)麻醉，开胸充分暴露心脏，取下心脏(保留3～4mm主动脉)并放置于预冷的4℃ K-H溶液中，用细线将心脏主动脉根部固定于Langendorff装置上，在左心耳处剪一小口，将乳胶水囊经左心耳开口处轻柔插入左心室，经Powerlab连接于计算机LabChart软件持续记录心肌血流动力学指标。离体心脏经K-H溶液持续灌注15 min，待心脏恢复正常心功能活动后，分别对各组进行处理。CON组：持续灌注K-H溶液190 min；I/R组：K-H灌注溶液灌注30 min后，全心停止灌注40 min，再灌注120 min；DEX组：用含右美托咪定(10nM)的K-H溶液持续灌注30 min，余停灌再灌处理同I/R组；YOH组：用含育亨宾1(M)的K-H溶液持续灌注30 min，余停灌再灌处理同I/R组组；DEX+YOH组：停灌前用含有右美托咪定和育亨宾的K-H灌注液灌注30 min，余停灌再灌处理同I/R组。

1.2.3 大鼠心功能指标的检测 分别于大鼠平衡末(T1)、缺血前(T2)、再灌注120 min末(T3)检测大鼠心功能(HR、LVDP、LVEDP、±dp/dtmax)。

1.2.4 ELISA检测cTnI水平 取再灌注120 min末冠脉流出液，按照试剂盒说明书进行检测。

1.2.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 实验结束后，取大鼠左心室组织，按照 TUNEL试剂盒说明书常规操作。用光学显微镜观察心肌细胞凋亡情况。一般情况下凋亡细胞核呈棕黄色或棕褐色，在400高倍镜下每张切片随机选取10个不同视野，计算凋亡细胞数和总细胞数，并计算其比值，取其平均值为细胞凋亡指数(%)。

1.2.6 Western Blot检测CRT、 GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表达 取心室肌肉组织100 mg，放置于冰上研磨，移至EP管中，加入蛋白裂解液与蛋白酶抑制剂的混合液，4℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液用BCA法检测蛋白浓度。配置10%分离胶和5%浓缩胶，加样，聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流半干法转膜，用5%脱脂奶粉TBST缓冲液封闭1 h，分别置于CRT、 GRP78、Caspase-12、CHOP的1∶1 000一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜后用相应的1∶10 000荧光二抗孵育1 h；ECL测定大鼠蛋白表达水平。目的蛋白的相对表达水平通过CRT、 GRP78、Caspase-12、CHOP的平均灰度值与相应内参照蛋白GAPDH的平均灰度值的比值表示。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标的变化 与CON组比较，其余4组HR、LVDP、±dp/dtmax均显著降低，LVEDP均明显升高 (P<0.05)；与I/R组相比，DEX组HR、LVDP、±dp/dtmax均明显升高，LVEDP均明显下降(P<0.05)；与DEX组相比，YOH组及DEX+YOH组HR、LVDP、±dp/dtmax均明显降低，LVEDP均显著增加(P<0.05)。各组HR、LVDP、LVEDP和±dp/dtmax在时间点与组别间存在交互作用(P<0.05，见表1)。

表1 各组大鼠不同时点心功能比较

2.2 各组大鼠冠脉流出液cTnI相对浓度的比较 与CON组比较，其余各组cTnI相对浓度均显著增加(P<0.05)；与I/R组比较，DEX组cTnI浓度显著降低(P<0.05)；与DEX组相比，YOH组、DEX+YOH组cTnI浓度显著增加(P<0.05， 见表2)。

表2 各组冠脉流出液cTnI浓度、心肌细胞凋亡指数的变化

2.3 心肌细胞凋亡情况 与CON组比较，其余各组心肌细胞凋亡率均显著增加P<0.05)；与I/R组比较，DEX组心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；与DEX组比较，YOH组、DEX+YOH组心肌细胞凋亡率显著增加(P<0.05，见表2、图1)。

A:CON组;B:DEX组;C:YOH组;D:DEX+YOH组;E:I/R组。图1 TUNEL法检测各组心肌细胞凋亡情况(×400)

2.4 各组大鼠心肌CRT、 GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白表达水平比较 与CON组比较，其余各组CRT、 GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白表达水平均明显升高 (P<0.05)；与I/R组比较，DEX组CRT、 GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与DEX组比较， DEX+YOH组CRT、 GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白表达水平显著增加(P<0.05，见图2、3)。

A:各组大鼠离体心脏GRP78、CRT蛋白印迹图；B:各组大鼠离体心脏GRP78/GAPDH 、CRT/GAPDH蛋白表达量；a：与Control组比较，P<0.05; b：与I/R组比较，P<0.05; c：与DEX组比较，P<0.05。图2 Western-blot检测各组大鼠离体心脏GRP78、CRT蛋白印迹图及其蛋白表达量

A:各组大鼠离体心脏CHOP、caspase-12蛋白印迹图；B:各组大鼠离体心脏CHOP/GAPDH 、caspase-12/GAPDH蛋白表达量；a：与Control组比较，P<0.05;b：与I/R组比较，P<0.05;c：与DEX组比较，P<0.05。图3 Western-blot检测各组大鼠离体心脏CHOP、caspase-12蛋白印迹图及其蛋白表达量

3 讨论

右美托咪定作为一种高选择性α2肾上腺素受体激动剂，目前广泛应用于ICU及麻醉手术过程中，因其具有剂量依赖性的镇静、镇痛、抑制交感活动、维持血流动力学稳定等作用[3]，被认为是一个极具应用前景的药物[4]。研究表明：右美托咪定可以减轻肺、脑、肾等多种器官的缺血再灌注损伤[5-6]。但于承琨等[7]报道DEX并不能减轻大鼠体外循环肺损伤，可能与用药剂量偏小有关。本研究结果显示，与对照组比较，缺血再灌注组心功能显著下降，心肌损伤标志物cTnI、心肌细胞凋亡指数明显增加，表明心肌缺血再灌注损伤模型复制成功。而给予DEX预处理的组别，大鼠心功能指标明显改善，cTnI与凋亡指数显著减少，表明DEX的确具有显著的抗心肌I/R损伤作用。这与Zhang等[8]的报道一致。

MIRI是指在心肌缺血基础上恢复血流灌注后，组织细胞功能障碍及结构破坏更加加重，甚至发生不可逆损伤的现象。在众多诱发因素中，细胞凋亡是目前公认的主要原因。已知的调节细胞凋亡途径包括线粒体途径、死亡受体途径，内质网凋亡途径，而内质网凋亡途径日益成为人们研究凋亡的热点。MIRI时引起的缺血缺氧及钙超载等会导致内质网稳态失衡、功能紊乱，这些病理机制将引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的发生。ERS成为多种药物治疗MIRI的靶点[9]。GRP78是内质网的钙离子结合分子伴侣蛋白，能介导细胞蛋白质成熟、维系细胞正常功能，当细胞处于ERS时，GRP78的表达会明显升高从而与内质网中的错误折叠和未折叠蛋白结合，减少其在细胞内的聚集，达到维持内质网内环境稳定的作用。由此可知，GRP78蛋白的高表达可以作为标志ERS发生的最敏感信号分子[10]。钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网内重要的Ca2+结合蛋白，具有参与维持细胞钙稳态、调节细胞凋亡的作用，是ER驻存的另一重要应激蛋白和ERS的重要标志[11]。本研究结果显示，与 CON组相比，I/R组GRP78、CRT 蛋白表达水平显著升高，提示缺血再灌注可诱发心肌发生严重的ERS。而与I/R组比较，DEX组GRP78与CRT蛋白表达明显减少，说明DEX预处理可以有效抑制I/R导致的过度内质网应激。

适度的ERS可通过处理异常蛋白等恢复内环境稳态，是一种保护机制。但持久或过度的ERS会通过活化相关因子及途径诱发细胞凋亡，给机体带来不利影响。CHOP属于C/EBP转录因子家族成员，具有特异的ERS转录因子，CHOP的表达上调被认为在ERS诱导的细胞凋亡中起重要作用[12]。半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase-12)激活途径是内质网特有的凋亡途径。在正常生理情况下，Caspase-12蛋白通常以无活性的酶原形式保留于内质网外膜上，当过度或长时间的内质网应激将激活酶原，进一步再激活下游分子，最终导致细胞凋亡发生[13]。CHOP与caspase-12的高表达，提示内质网应激已经不能维持细胞的正常形态功能，细胞开始转向死亡或凋亡。本研究结果显示，与 CON组相比，I/R组CHOP与caspase-12蛋白表达明显升高，提示缺血再灌注可诱发心肌发生严重的ERS并促进凋亡的发生。而与I/R组比较，DEX组CHOP与caspase-12蛋白表达显著减少，说明DEX预处理可以通过CHOP及caspase-12途径有效抑制过度内质网应激所致的细胞凋亡，进而保护缺血心肌的结构与功能。Li等[14]通过建立在体糖尿病大鼠MIRI及缺氧复氧细胞模型，观察到DEX预处理可以减轻ERS相关蛋白GRP78及CHOP等表达，说明DEX可以抑制糖尿病大鼠MIRI所致的过度ERS，从而起到心肌保护作用。育亨宾是α2肾上腺素能受体阻滞剂。α2肾上腺素能受体是一类膜表面糖蛋白，激活后引起胞内信号转导通路激活进而引起一系列生物反应。本实验结果显示：单独应用育亨宾对I/R心肌心功能、心肌梗死面积及凋亡等均无明显影响。但育亨宾可以逆转DEX的心肌保护效果，且与DEX组比较，DEX+YOH组的ERS及其介导凋亡的相关蛋白表达均升高，说明DEX预处理减轻MIRI的机制可能部分与激活α2肾上腺素能受体有关。

综上所述，右美托咪定预处理可以减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，其机制可能与激动α2-肾上腺素能受体，抑制过度内质网应激及其介导的凋亡有关。