p63基因在妇科恶性肿瘤中的研究进展

于婷，杨惠娟，韩旭

(哈尔滨医科大学附属第一医院生殖医学科，哈尔滨150001)

研究显示，超过50%的人类癌症的特征是p53基因发生突变[1]。p53基因是维护体细胞基因组稳定性并在细胞凋亡中发挥关键作用的“基因卫士”，作为明确的抑癌基因被广泛深入的研究[2]。p63基因于20世纪90年代末被鉴定出来[3]，作为p53基因的同源基因，p63基因在结构和生物学功能上与p53基因相互联系，p63基因介导的信号转导通路在细胞增殖、凋亡、分化及细胞黏附迁移过程中起重要的调控作用[2，4]。不同的是，p63基因在人类肿瘤中极少发生突变，但在多种鳞状上皮源性恶性肿瘤中表达异常，参与子宫颈癌和膀胱癌的发生、发展[5]。在人类肿瘤的研究进展中，各种p63亚型的表达水平与临床结果的关系存在矛盾[6]。研究发现，TAp63α(p63选择性剪切的产物)在胚胎细胞向表皮细胞的分化、增殖、自我更新以及抑制衰老和凋亡方面具有致癌功能，而ΔNp63α具有维持上皮干细胞和诱导细胞周期阻滞、衰老和凋亡的肿瘤抑制功能[2]。另一项研究则表明，ΔNp63α是鳞状上皮细胞中主要的p63亚型，定位于基底细胞，而且在包括皮肤、头颈部和肺在内的多个组织的鳞状细胞癌中过表达[7]。目前不同p63亚型的表达水平在妇科恶性肿瘤中的差异、与临床结果的联系以及能否更好地应用于妇科肿瘤的临床诊疗及预后均受到广泛关注。现就p63基因在妇科恶性肿瘤中的研究进展予以综述。

1 p63的结构和生物学功能

1.1p63的结构 人类p63基因位于染色体的3q27～3q29区，由15个外显子和2个启动子组成[8]。p63基因主要包括N端的转录激活域、核心DNA结合域和寡聚域，根据C端剪接不同分为p63α、p63β和p63γ，根据N端剪接不同，分为具有转录激活域的全长p63(TAp63)和缺失转录激活域的截短p63(ΔNp63)；另外，p63还具有独特的C端SAM(sterile amotif)域，控制蛋白质-蛋白质相互作用的重要调控序列[9-10]。TAp63含有39-氨基-酸性N端延伸，可以模拟p53功能[3，9]；ΔNp63起始于一个独特的14个氨基酸的N端，缺少结构域，但可以通过反式激活结构域来调节基因转录[7，9]。TAp63功能类似于p53，能够调节下游靶基因的表达，阻滞细胞周期并诱导凋亡，而ΔNp63可通过竞争DNA结合位点拮抗p53和TAp63，发挥类癌基因的作用[9]。近年来，已经报道了几种新的p63亚型，例如，Moses等[7]发现，在p63蛋白N端存在一种亚型，位于第4外显子替代翻译的起始位点，它在表皮角质形成细胞中缺少ΔNp63亚型的前26个氨基酸。

1.2p63的生物学功能 p63与p53基因家族在结构和功能上具有同源性，p63蛋白可以作为转录因子结合p53应答元件(response element，RE)及p63-RE，直接或间接调节下游靶基因，激活各种信号通路，参与多种生物学功能的调节，而p63处于这一调控网络的关键点，在细胞周期调控、凋亡、分化、细胞黏附迁移以及内环境稳定方面发挥关键作用[11]。

DNA损伤诱导TAp63通过激活外源性及内源性凋亡途径介导细胞凋亡。在Saos-2细胞系中转染TAp63，过表达的TAp63可导致细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子表达上调，阻滞细胞周期，TAp63还能够通过转录抑制增殖相关基因的表达，抑制细胞增殖[7]。ΔNp63能够激活与细胞生长和增殖相关的基因，被ΔNp63持续激活的信号转导及转录激活因子3可参与多种癌细胞的过度增殖，还可介导ΔNp63对表皮生长因子受体的激活，表皮生长因子受体反过来通过磷脂酰肌醇-3-激酶通路诱导ΔNp63的表达[12]，而磷脂酰肌醇-3-激酶通路的活性与许多人类疾病有关，包括糖尿病和癌症[10]。有研究表明，在80%肺鳞状细胞癌中，ΔNp63过表达的同时下调Ras相似物A(Ras homologous A，RhoA)和转化生长因子-β2受体(RhoA和转化生长因子-β2在肺鳞状细胞癌中具有肿瘤抑制作用)，进而发挥ΔNp63癌基因的作用[13]。另外，ΔNp63还可通过负调节某些细胞周期抑制因子，促进细胞增殖。有研究表明，在鼻咽癌细胞周期中，ΔNp63基因剔除导致了细胞周期素依赖激酶抑制剂上调，包括p27和p57在信使RNA和蛋白的表达，增加了G1期细胞和凋亡细胞的数量[10]。不同p63亚型在参与不同肿瘤系细胞周期调控及凋亡过程中可能发挥相似或相反的作用，调控机制也存在差异，需要进一步深入系统的研究。

p53家族成员在基因表达和翻译后修饰水平上受到调控，也可通过泛素化及类泛素化的修饰来维持其在细胞中的稳定性及活性[10]。已经发现几种p63的泛素E3连接酶，它们能够泛化TAp63和ΔNp63，调控p63蛋白质水平的稳定，但鼠双微粒体基因(murine double minute，MDM)2/MDMX介导的p63蛋白稳定性仍有待研究[4]。

近年来，微RNA(microRNA，miRNA)成为研究的热点。现已发现p63可以调节一组不同的miRNA，其中一个公认的靶点就是miR-205，它是膀胱癌和胰腺癌上皮-间充质转化及转移的抑制因子[14]。相反，p63是miR-20a-5p的靶基因，miR-20a-5p可直接与p63的3′非翻译区结合，抑制其翻译，进而调节p53和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因在肝糖原合成过程中的表达，而p63基因剔除可以逆转miR-20a-5p抑制诱导的蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和糖原合成酶激酶的生成减少和激活，表明p63对胰岛素信号通路有不利影响[15]。此外，在结肠癌细胞中，TAp63过表达可显著抑制糖原合成酶激酶-3β依赖的脂肪酸合成[16]。p63蛋白与代谢紊乱的相关性正被逐渐认知[17]，对于研究代谢性疾病的发病机制可能有帮助。

p63与肿瘤侵袭和转移的关系各文献报道不尽相同，目前尚无定论。已有研究证实，ΔNp63α可调节参与细胞黏附、运动和迁移的基因[包括神经钙黏素、β联蛋白和E盒锌指结合蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)1/2]，抑制癌症进展和上皮向间充质细胞的转变[18]。粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)和Src是已知的细胞迁移调节因子，在E6/E7-人包皮角质形成细胞中，p63的表达可促进依赖Src-FAK机制的细胞迁移和侵袭，而剔除p63基因后，许多细胞侵袭和转移相关基因的表达均发生了改变，如Src、FAK、Akt、c-Jun和基质金属蛋白酶14的表达均降低[19]。在乳腺癌雌激素受体α阳性的MCF7细胞中，雌激素激活雌激素受体α转录，进而诱导ΔNp63的表达，而ΔNp63能够诱导整合素β4表达，使Akt磷酸化，增强细胞运动能力[20]。一项有关宫颈癌的研究表明，TRIM(tripartite motif)29基因可调控p63介导的宫颈癌细胞的黏附和侵袭，TRIM29基因剔除改变了整合素的表达，增加了ZEB1和整合素1的表达，同时显著降低了TAp63α的表达，进而抑制TAp63α诱导的细胞黏附活性增强[21]。肿瘤细胞通过上调或抑制不同亚型p63的表达影响细胞黏附和迁移，可能作为关键因子参与上皮-间充质转化，但其机制目前尚不明确，还有待进一步研究。

p63还可以调节细胞分化，但详细机制目前尚不清楚。有研究表明，p63与Notch通路交叉作用，维持角化细胞自我更新和分化的平衡[8,10,14]。一项研究显示，β和γ亚型TAp63是人类皮肤终末分化过程中必不可少的转录开关，可以被人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的E6癌蛋白特异性降解，与Notch协同作用，有可能在HPV相关的癌变过程中作为肿瘤抑制因子发挥重要作用[22]。

2 p63与妇科肿瘤的关系

2.1p63与宫颈癌 宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤，发病率居生殖道恶性肿瘤的第二位，在某些发展中国家甚至位居首位[23]。随着宫颈癌筛查技术的普及，近年来宫颈癌的发病率和病死率有所降低，在美国，2018年有4 170位女性死于宫颈癌[24]。

宫颈癌是一种感染性疾病，HPV感染与宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及子宫颈癌的发生、发展密切相关，持续反复感染HPV是宫颈细胞恶性转化的主要病因，HPV含有8个基因编码区，其中E6、E7基因起主要作用[25]。Martens等[26]在研究宫颈癌时发现，p63蛋白与HPV感染密切相关。贾英等[27]的研究表明，ΔNp63与HPV16 E7的表达在CIN中具有较好的一致性。朱靖等[28]进一步证实，p63α在宫颈癌细胞株中有表达，瞬时转染HPV E6后，p63α的表达显著降低，提示p63α降低在宫颈癌发生过程中发挥作用。目前国内外有关p63与HPV相互作用机制的研究较少，一项国外研究表明，HPV E7蛋白可诱导p63转录，该转录可调控DNA损伤反应通路，促进DNA损伤的修复，这可能为宫颈癌的治疗提供新途径[29]。

经过不断的探索研究，p63在CIN和宫颈癌中的表达取得了一定的进展。赵时梅等[30]的研究表明，ΔNp63在宫颈腺癌中无表达，在宫颈鳞癌中，低分化组ΔNp63阳性表达率高于中、高分化组，临床Ⅲ～Ⅳ期高于0～Ⅰ期，提示ΔNp63可能与预后有关，陈玮和赵涌[31]的研究结果与此一致。吴瑾等[32]通过免疫组织化学法研究ΔNp63在各级别CIN中的表达，选取的对照组为慢性宫颈炎组，结果显示，慢性宫颈炎组ΔNp63阳性表达率为4.76%，CINⅠ级组为84.21%，CINⅡ级组为100%，CIN Ⅲ级组为100%，而且CIN各组的染色强度均随病情进展而增强。

虽然p63的表达与宫颈病变方面的研究取得了一定的进展，但不同p63亚型在宫颈癌中的表达目前尚不明确。Park等[33]进一步应用实时定量逆转录-聚合酶链反应检测正常宫颈组织和宫颈癌组织中的TAp63和ΔNp63信使RNA的表达水平，结果显示，ΔNp63信使RNA的过表达参与了宫颈癌的发生，而非TAp63信使RNA的过表达；进一步分析得出，ΔNp63/TAp63信使RNA在宫颈癌组织中的表达比值显著高于正常宫颈组织，较ΔNp63信使RNA具有更好的敏感性和诊断价值，ΔNp63/TAp63信使RNA表达率阳性的宫颈癌患者的生存率低于ΔNp63/TAp63信使RNA表达率阴性的宫颈癌患者，故ΔNp63/TAP63信使RNA表达比值可作为宫颈癌的诊断和预后指标。此外，宫颈癌中ΔNp63/TAp63信使RNA阳性表达率与肿瘤大小和增殖标志物Ki-67的高表达有关，并且ΔNp63/TAp63信使RNA在低度宫颈鳞状上皮内病变和高度宫颈鳞状上皮内病变组织中的表达水平高于正常宫颈组织，低于宫颈癌组织。由此可见，不同p63亚型可以相互作用或干扰，最终p63对生物学行为的影响可以通过各亚型之间的平衡进行调控，这种失衡同样存在于Ⅰ/Ⅱ级子宫内膜腺癌中[34]。

2.2p63与卵巢癌 卵巢癌是一组在肿瘤起源、病理分级、危险因素、预后和治疗方面均具有异质性的恶性肿瘤，是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，目前主要通过手术和铂类为主的化疗进行治疗，早期多无症状，疾病易复发，预后差。在美国，卵巢癌占女性所有恶性肿瘤的2.5%，病死率约为5%，2018年有14 070位女性死于卵巢癌[24]。在一项小鼠实验中发现，p63基因缺失小鼠的活卵母细胞数量略高于无基因缺失小鼠，进一步研究表明，在缺乏TAp63的情况下，重要的卵母细胞编辑功能丧失，这些效应伴随着TAp63磷酸化[3]。目前关于TAp63与卵巢癌发生、发展、预后方面的研究较少，p63蛋白作为转录因子能够结合p53-RE和p63-RE，直接或间接调节下游靶基因，参与大量信号转导通路。未来能否利用TAp63的生物学功能克服卵巢癌化疗的耐药性，更好地保护卵巢功能，值得研究者关注。

死亡相关蛋白激酶-1(death-associated protein kinase-1，DAPK1)是一种钙离子/钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸激酶，能够介导细胞凋亡，DAPK1下调可见于多种癌症，包括胰腺癌、肺癌和头颈部肿瘤[35]。有研究表明，DAPK1基因沉默阻止了TAp63介导的多药耐药基因1和多药耐药相关蛋白3的下调以及胶质毒素和紫杉醇连续治疗后的自噬细胞死亡，DAPK1介导的TAp63上调是诱导耐药肿瘤细胞凋亡的关键途径之一[36]。在对卵巢癌进行再次化疗前，DAPK1和TAp63水平可用作诊断或判断耐药的因素，但具体机制目前尚不清楚。

另一项针对489例高级别浆液性卵巢癌患者的研究表明，激活p63可触发细胞周期停滞、凋亡和衰老，即使在没有p53的情况下，也可观察到p63在遗传毒性应激下补偿癌细胞中p53的丢失[7]。miR-130b是被TAp63反式激活结构域转录激活的直接下游靶标，它可以建立反馈环路，在转录上激活TAp63，并下调致癌亚型ΔNp63，具有克服p53突变的潜力[37]。目前已有研究表明，p53家族成员可通过相关反馈环调节彼此的表达，尤其在错综复杂的各种信号通路网络中[4，7]。同时，还有研究表明，Scl-miR-130b不仅在人卵巢癌的原位小鼠模型中靶向并有效地传递miR-130b，而且还可以增强卵巢肿瘤对一线治疗剂顺铂的反应[37]。因此，miR-130b/TAp63轴是临床上有前景的卵巢癌治疗策略，但仍需进一步研究确定p63特定亚型在卵巢癌miRNA转录中的作用。

了解化疗诱导卵巢早衰的分子机制可以确定预防靶点。有研究表明，激活TAp63α需要启动激酶细胞周期检查点激酶2和Ⅰ型酪蛋白激酶，而抑制这些激酶及其上游激酶可使小鼠卵巢中的卵母细胞免于凋亡；将经过处理的卵巢转移到不孕的雌性宿主体内可以恢复其生育能力，并容易产生正常后代[38]。通过干扰激活TAp63α激酶进一步抑制TAp63α，有望成为卵巢癌治疗期间预防卵巢早衰的一种有价值的方法。

3 小 结

目前p63基因在妇科恶性肿瘤中的研究取得了较大进展。p63基因作为关键节点参与了肿瘤发生、发展过程中大量的信号通路，受正负反馈调节[14]，与宫颈病变组织分类、临床分级和预后相关，并在克服卵巢癌耐药性和保护生育能力方面发挥作用。但目前对不同p63亚型的生物学功能尚无完整、系统的认识，进一步了解妇科恶性肿瘤形成过程中不同p63亚型使癌细胞更易具备侵袭性表型并维持其在同一组织细胞中表达平衡的机制，有助于通过p63介导的通路解决恶性肿瘤耐药性的问题，具有潜在的研究意义和临床应用价值，这也为妇科恶性肿瘤的诊断和治疗提供了新思路。