聚谷氨酸接枝聚乙二醇@碳酸钙遮蔽体系用于提高聚乙烯亚胺基因转染效率

郭兆培, 林 琳, 陈 杰, 田华雨, 陈学思

(中国科学院长春应用化学研究所, 生态环境高分子材料重点实验室, 长春 130022)

随着科技的发展, 基因治疗逐渐在基础研究及临床应用领域被认可, 用于治疗基因相关疾病, 尤其是癌症治疗[1,2]. 传统的放疗、 化疗和手术治疗给患者带来极大的痛苦, 并且容易复发, 产生并发症等. 基因治疗是一种从核酸水平纠正错乱及异常基因的新型治疗手段, 有望从根本上治愈基因相关的各种疾病[3～5]. DNA及RNA等治疗基因, 一方面容易在循环过程中被血液中的酶降解, 另一方面, 即使到达肿瘤组织, 其庞大的体积也很难穿过细胞膜, 从而失去治疗作用[6], 因此, 开发安全且高效的基因担载体系显得尤为重要. 阳离子聚合物, 尤其是聚乙烯亚胺(PEI), 具有易于功能化修饰、 相对生产成本较低和免疫原性低等特点, 已成为生命科学研究的重要工具, 具有潜在的临床基因治疗应用价值. 在生理学环境下, PEI可与带负电的DNA(或RNA)通过静电作用形成纳米颗粒, 在有效保护DNA的同时, 大大压缩了DNA的体积. 这些纳米级复合物颗粒可以通过大胞饮、 网格蛋白介导及小窝内陷等方式被细胞内吞, 在细胞内释放基因物质, 对靶细胞的特定基因进行调控, 从而完成基因治疗[7～9]. 高分子量的PEI(分子量25000)具有较高的转染效率, 但细胞毒性较大, 低分子量的PEI(分子量1800)具有较小的细胞毒性, 但转染效率较低. 因此, 本课题组从多个角度对PEI进行改性以降低细胞毒性并提升转染效率, 利用交联或修饰低分子量的PEI[10～12], 或对高分子量PEI进行生物相容性修饰等[13～15], 可以在一定程度上提高转染效率并降低细胞毒性.

当阳离子聚合物用于体内时, 过多的正电荷易与血液中的负电蛋白结合, 形成较大颗粒, 被机体清除. 通常的解决方法是引入遮蔽体系遮蔽多余的正电荷, 如在PEI/DNA纳米粒表面包裹pH响应性电荷翻转遮蔽体系, 引入负电的聚合物, 或者通过pH敏感键将聚乙二醇(PEG)键合到纳米粒子上, 并取得了一定的体内应用效果[16～18]. 载体体系中PEG的含量对体内循环起着关键作用, 在上述体系中, PEG的含量相对较少, 因此, 其体内循环效果并没有得到太大的提升. 但纳米颗粒表面过多的PEG会严重降低细胞对纳米颗粒的内吞, 进而影响治疗效果[19,20]. 因此, 如何平衡、 解决这一矛盾成为提高载体体内应用的关键.

为了改善PEI在体内的应用效果, 同时降低细胞对纳米颗粒的内吞及转染的影响, 本文构建了聚谷氨酸接枝聚乙二醇@碳酸钠(PPG@CaCO3)遮蔽体系, 用于遮蔽DNA/PEI复合物颗粒. 通过在聚谷氨酸上接枝较多的PEG, 达到更好的血液循环的目的, 通过在PPG上生长CaCO3解决引入过多PEG时引起的转染效率下降的问题. 研究结果表明, PPG@CaCO3遮蔽体系不仅提升了PEI的转染效率, 而且在应用于小鼠体内时, 显著延长了载体的血液循环时间.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

PEI(Mw=25000, PEI-25000,Mw=1800, PEI-1800)、 噻唑蓝(MTT)、 胰蛋白酶和多聚甲醛粉末(纯度95%), 美国Sigma-aldrich公司; 谷氨酸苄酯-N-羧酸内酸酐(BLG-NCA), 上海吉尔生化有限公司; 无水氯化钙, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 碳酸钠和磷酸三钠, 北京化工厂; 氨基化甲氧基聚乙二醇(mPEG5K-NH2), 北京键凯科技有限公司; 荧光素酶试剂盒, 美国Promega生物技术有限公司; DMEM培养基、 新生牛血清(FBS)和Lyso Tracker green, 美国Thermo Fisher Scientific; Cy5-DNA(invitrogen), 广州锐博生物科技有限公司; 人宫颈癌细胞(HeLa细胞)、 人乳腺癌细胞(MCF7)及中国仓鼠卵巢细胞(CHO), 中国科学院上海细胞库; BALB/C小白鼠, 北京维通利华实验动物技术有限公司;ZetaPotential/BI-90型Zeta电位及粒度分析仪, 美国布鲁克海文仪器公司(Brookhaven); FC500型流式细胞仪, 美国贝克曼库尔特公司(Beckman); ZESS LSM780型激光共聚焦显微镜, 德国Zeiss公司; Nikon-TE2000U型倒置荧光显微镜, 日本Nikon公司; 2030-101型荧光光度计, 美国Promega公司; Merlin型扫描电子显微镜(SEM), 德国Zeiss公司; Tecan Infinite M200型多功能酶标仪, 瑞士Tecan集团公司.

1.2 实验过程

1.2.1 PPG@CaCO3及PPG@Ca3(PO4)2的制备 参照文献[21]方法制备高分子载体PPG; 将1 g PPG、 无水氯化钙、 碳酸钠及磷酸三钠分别溶于100 mL去离子水配成溶液; 将23.7 mL氯化钙溶液缓慢滴加到40 mL PPG溶液中搅拌均匀; 在高速搅拌下, 缓慢滴加45.2 mL碳酸钠溶液或46.6 mL磷酸三钠溶液; 滴加完成后继续搅拌4 h以上; 将产物溶液转入透析袋(截留分子量3500)中, 在去离子水中透析48 h, 期间换水5次并保持水的pH值在7.4左右; 用滤纸滤掉较大颗粒, 滤液冻干待用.

1.2.2 粒径和电位测定 测定遮蔽体系PPG@CaCO3及PPG@Ca3(PO4)2的粒径和电位时, 将PPG@CaCO3及PPG@Ca3(PO4)2溶于水中, 配制成0.2 mg/mL的溶液, 测定粒径大小及表面电位. 测定复合物颗粒DNA/PEI/PPG@CaCO3及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2的粒径和电位时, 选用荧光素酶质粒DNA(pGL3)与基因载体材料(PEI)进行复合. 首先, 配制0.1 mg/mL DNA水溶液, 将DNA与一定浓度的PEI混合均匀, 控制PEI的浓度为0.4 mg/mL, 静置, 稳定30 min, 然后加入等体积不同浓度的PPG@CaCO3或PPG@Ca3(PO4)2溶液混合均匀, 静置20 min, 用纳米粒度电位仪测量粒径大小及表面电位.

1.2.3 细胞毒性实验 取对数生长期的HeLa细胞, 接种于96孔培养板, 细胞密度为1.0×104Cell/孔, 每孔加入180 μL DMEM培养液(含10% FBS, 100 Units/mL青霉素, 100 μg/mL链霉素), 于37 ℃及体积分数5%的CO2培养箱中培养24 h, 小心吸除培养液; 每孔中加入200 μL不同含量的PEI-25000, PEI-25000/PPG@CaCO3, PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2, PEI-1800, PEI-1800/PPG@CaCO3及PEI-1800/PPG@Ca3(PO4)2的DMEM溶液, 继续培养48 h; 每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL); 在37 ℃继续孵育4 h; 小心除去培养液, 每孔加入200 μL DMSO, 振荡5 min; 用酶标仪检测492 nm处光吸收. 细胞存活率[Cell viability(%)]按下式计算:

Cell viability =(Asample/Acontrol)×100%

式中:Asample为单纯样品或复合物颗粒的细胞样品孔的吸收;Acontrol为空白细胞(作为参照)的吸收, 每组实验做4个平行对照, 重复3次.

1.2.4 细胞转染 分别用HeLa, MCF7及CHO细胞进行细胞转染实验, 以pGL3为报告基因. 将细胞接种于96孔板, 细胞密度为1.0×104Cell/孔, 培养24 h, 分别加入复合物颗粒. 将PEI与DNA按照不同的质量比混合均匀, 其中DNA用量为0.2 μg/孔, 静置30 min, 加入不同质量的PPG, PPG@CaCO3或PPG@Ca3(PO4)2混合均匀, 并保持最终体积10 μL, 静置20 min后加入96孔板中; 培养48 h后, 小心移去培养液, 用pH值为7.4的磷酸盐(PBS)缓冲溶液洗涤2次, 每孔加入50 μL细胞裂解液, 于-20 ℃冰箱中冷冻1 h, 取出, 溶解后吹打混合均匀; 取20 μL裂解液用于荧光素酶分析系统检测. 另取25 μL裂解液用于BCA法检测, 测定裂解液中的总蛋白含量, 最终结果的荧光素酶活性表示为每毫克蛋白的相对单位(RLU/mg Protein).

1.2.5 细胞内吞 取对数生长期的HeLa细胞, 经胰酶消化后用DMEM稀释, 按每孔2.0×105Cell的密度接种于6孔板中, 置于37 ℃及CO2体积分数为5%的孵箱中培养24 h; 更换新鲜培养液, 然后分别加入Cy5-DNA/PEI, Cy5-DNA/PEI/PPG, Cy5-DNA/PPG@CaCO3和Cy5-DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2, 继续培养4 h; 吸出培养液, 用PBS缓冲溶液清洗3次, 用0.25%的胰酶溶液消化, 用10% FBS的DMEM培养液中和胰酶, 将细胞悬浮液收集至小型离心管(EP管)中, 离心收集细胞, 吸出上清液, 然后用500 μL PBS溶液洗涤2次, 用流式细胞仪检测载体材料对Cy5-DNA的内吞情况.

1.2.6 激光共聚焦显微镜测试 依次用浓盐酸、 酸液(重铬酸钾、 浓硫酸、 双蒸水用量分别为100 g, 100 mL, 100 mL)浸泡盖玻片至少48 h, 用乙醇浸泡48 h, 用去离子水洗涤后干燥; 将处理过的盖玻片放入6孔板, 紫外光灭菌处理, 将HeLa细胞以每孔1.5×105Cell的密度接种于盖玻片上, 培养24 h, 更换新鲜培养液, 然后加入各种载体与Cy5-DNA的复合物, 内吞4 h, 吸去废液, 用PBS轻轻清洗5次; 用4%多聚甲醛固定10 min, 吸弃废液, 再用PBS洗涤3次; 每孔加入1 μL DAPI(1 mg/mL)溶液, 标记细胞核, 1 min后吸出废液, 用PBS洗涤5次; 然后用新配置的Lyso Tracker green标记内涵体, 用PBS洗涤至少5次, 用甘油封片, 于4 ℃避光保存, 用激光共聚焦显微镜观察复合物颗粒在细胞内的分布情况.

1.2.7 药代动力学测试 取4～6周龄、 体重约为20 g的BALB/C小白鼠(所有实验程序均符合东北师范大学动物保护和使用委员会制定的实验动物指南), 分为5组, 每组3只, 分别尾静脉注射以下5组药物, Cy5-DNA, Cy5-DNA/PEI, Cy5-DNA/PEI/PPG, Cy5-DNA/PPG@CaCO3和Cy5-DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2, 其中Cy5-DNA的用量为1 mg/kg, 每只小鼠给药体积为200 μL. 在设定的时间点, 用带有肝素钠的微量移液器取血, 并转入收集管; 从每个样品中取样10 μL血液, 并用PBS稀释10倍, 转入黑色96孔板, 用多功能酶标仪检测Cy5-DNA的荧光, 同时以空白血液作为参比; 采用PKSolver法计算了Cy5-DNA在血浆中的半衰期(t1/2).

Scheme 1 Preparation of PPG@CaCO3(A) and PPG@Ca3(PO4)2(B)

2 结果与讨论

2.1 PPG, PPG@CaCO3及PPG@Ca3(PO4)2的制备及表征

Scheme 1给出PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2合成路线. 通过元素分析法测量了PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2中的钙含量分别为6.35%和10.9%.

2.2 粒径和电位

阳离子载体与DNA静电复合后通常会形成表面带电荷的纳米颗粒, 其大小、 表面电位及表面性质将对纳米颗粒在体内循环及细胞内吞产生重要的影响. 图1给出PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2的粒径分布及电位图. 由图1(A)可见, PPG@CaCO3的粒径约为100 nm, PPG@Ca3(PO4)2的粒径约为90 nm, 这可能是因为磷酸钙在PPG上的生长好于碳酸钙, 因而粒径较小. 由图1(C)和(D)可见, PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2的粒径接近, 但明显小于动态光散射的结果. 这与PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2表面含有大量的PEG有关, 导致水合粒径较大. 从图1(B)可以看出, PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2的纳米颗粒均为负电, 这有利于其与DNA/PEI的纳米颗粒进一步复合.

Fig.1 DLS(A), zeta potential(B) and SEM images(C, D) of PPG@CaCO3(a, C) and PPG@Ca3(PO4)2(b, D)

Fig.2 DLS(A), zeta potentials(B) and SEM images(C—E) of DNA/PEI-25000(a, C), DNA/PEI-25000/PPG@CaCO3(b, D) and DNA/PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2(c, E)

进一步比较了DNA/PEI, DNA/PEI/PPG@CaCO3及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2的粒径及电位情况. DNA/PEI形成的纳米粒子要小于DNA/PEI/PPG@CaCO3和DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2[图2(A), (C), (D), (E)]. 这是因为具有一定粒径的PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2通过静电吸附到DNA/PEI颗粒表面时会增加复合物颗粒尺寸.Zeta电位结果表明[图2(B)], 将PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2引入到DNA/PEI上, 大大降低了DNA/PEI的表面电位, 表面电位由原来的25 mV下降到10 mV以下. 较低的表面电位一方面会减少与其它负电物质的不必要结合, 另一方面还可以保持一定的与带负电的细胞膜的结合能力.

2.3 细胞毒性

图3给出不同浓度时PEI-25000, PEI-1800及其与PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2形成的复合物颗粒在HeLa细胞中的毒性. 由图3(A)可见, PEI-25000具有较大的细胞毒性, 未遮蔽PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2时, 当PEI浓度增加到20 μg/mL时, 细胞存活率迅速降至20%以下, PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2遮蔽后, 细胞存活率提升, 当PEI浓度为20 μg/mL时, 细胞存活率依然接近80%, 因此引入PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2可以有效降低阳离子对细胞的毒副作用. 由图3(B)可见, PEI-1800本身细胞毒性较低, 但随着其浓度的增加也会产生一定的细胞毒性, 用PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2遮蔽后可以降低细胞毒性.

Fig.3 Relative HeLa cell viability of various carrier concentrations(A) a. PEI-25000; b. PEI-25000/PPG@CaCO3; c. PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2.(B) a. PEI-1800; b. PEI-1800/PPG@CaCO3; c. PEI-1800/PPG@Ca3(PO4)2.

2.4 细胞转染效率

以荧光素酶质粒DNA(pGL3)为报告基因, 考察载体在不同细胞系的转染效率. 图4(A)给出PPG, PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2遮蔽DNA/PEI在HeLa细胞内的转染情况. 可以看出, DNA/PEI在质量比为1∶1.25时的转染效率略高于1∶5. 而当加入PPG和PPG@Ca3(PO4)2后, 载体转染效率均大幅度下降. 而DNA/PEI/PPG@CaCO3的转染效率不但没有降低, 反而提高近10倍. 对比DNA/PEI/PPG@CaCO3在不同质量比时的转染结果发现, 当质量比为1∶2.5∶2.5时, 具有最佳的转染效果. 进一步考察了PEI-1800的DNA/PEI体系, 得到了相似的结果[图4(B)], 即PPG@CaCO3遮蔽体系有利于提高DNA/PEI的转染效率. 但高分子量PEI体系的转染效果更好. 本文进一步研究了PEI-25000的DNA/PEI/PPG@CaCO3在CHO[图4(C)]和MCF7[图4(D)]细胞的转染情况. 在这2种细胞中, 遮蔽PPG@CaCO3后, 转染效率都有一定提高, DNA/PEI/PPG@CaCO3在CHO中最佳质量比为1∶2.5∶1.25, 而在MCF7细胞中质量比为1∶5∶2.5, 总体上差别不大.

Fig.4 Transfection efficiency of DNA/PEI, DNA/PEI/PPG, DNA/PEI/PPG@CaCO3, and DNA/PEI/PPG@ Ca3(PO4)2 at various mass ratios in HeLa(A, B), CHO(C) and MCF-7(D) cells(A, C, D) a. DNA/PEI-25000; b. DNA/PEI-25000/PPG; c. DNA/PEI-25000/PPG@CaCO3; d. DNA/PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2.(B) a. DNA/PEI-1800; b. DNA/PEI-1800/PPG; c. DNA/PEI-1800/PPG@CaCO3.

Fig.5 Flow cytometric analysis of cell endocytosis efficiency(A) and laser scanning confocal microscope observing particles intracellular transport(B) in HeLa cellsa. Control; b. DNA/PEI-25000; c. DNA/PEI-25000/PPG; d. DNA/PEI-25000/PPG@CaCO3; e. DNA/PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2.

2.5 细胞流式分析及激光共聚焦显微镜结果

图5(A)给出DNA/PEI, DNA/PEI/PPG, DNA/PEI/PPG@CaCO3及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2在HeLa细胞的内吞情况. 以空白细胞作为参比(Control), 由图5(A)可见, 所有组的内吞效率相差不大, DNA/PEI的内吞效率略高于DNA/PEI/PPG, 这可能是因为引入含有大量PEG的PPG体系, 过多的PEG对细胞内吞有一定的影响. DNA/PEI/PPG@CaCO3及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2的内吞效率略高于DNA/PEI, 这可能与遮蔽体系中的CaCO3和Ca3(PO4)2纳米颗粒有关, 引入颗粒性的遮蔽体系, 有利于提高细胞内吞. 与DNA/PEI相比, DNA/PEI/PPG@CaCO3和DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2略微提高了细胞内吞效率, 但DNA/PEI/PPG@CaCO3的细胞转染效率远高于DNA/PEI和DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2, 这不同于普遍认为的高细胞内吞效率与高细胞转染效率一致的观点. 因此, 本文通过激光共聚焦显微镜观察体系被细胞内吞后的情况. 由图5(B)可见, 采用载体担载Cy5-DNA(红色荧光), 通过Lyso Tracker green进行内涵体染色(绿色荧光)及DAPI进行细胞核染色(蓝色荧光)观察体系进入细胞情况. 研究发现, DNA/PEI, DNA/PEI/PPG及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2在细胞核周围的荧光点比较少而且比较小, 但DNA/PEI/PPG@CaCO3显示出更亮、 更大的荧光点. 通常, 纳米颗粒被细胞内吞后形成内涵体, 具有弱酸性, 内涵体会进一步结合溶酶体, 消化内吞的物质. 因此, 如果载体不能从内涵体逃逸, 基因物质将会被消化降解. DNA/PEI/PPG@CaCO3体系遇酸会产生CO2气体, 有利于涨破内涵体, 使基因物质进入细胞, 因此具有较高的转染效率.

2.6 药代动力学

为考察载体是否适合体内应用, 本文通过药代动力学研究载体的体内循环情况. 分别将载有Cy5-DNA的纳米颗粒及Cy5-DNA通过尾静脉注射到小鼠体内. 注射剂量为1 mg/kg Cy5-DNA. 由图6(A)可见, 在注射后不同时间点(0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12和24 h)取血, 检测Cy5-DNA的荧光. 随着时间的增加, Cy5-DNA及Cy5-DNA/PEI组血液中Cy5-DNA浓度迅速下降到较低水平. Cy5-DNA/PEI/PPG@CaCO3及Cy5-DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2与Cy5-DNA/PEI/PPG循环情况接近, 经过24 h, 这3个体系中Cy5-DNA在血液中的浓度与2 h时Cy5-DNA组在血液中浓度接近, 因此, Cy5-DNA/PEI/PPG@CaCO3, Cy5-DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2及Cy5-DNA/PEI/PPG大大提高了Cy5-DNA在血液中的循环时间. 可见, 引入PPG可以有效增加血液循环时间, 并且在PPG上生长一定量的碳酸钙及磷酸钙不会影响血液循环效果. 本文对药代动力学数据进行进一步分析, 采用PKSolver法, 计算了载体担载Cy5-DNA在血浆中的半衰期. 由图6(B)可见, 没有载体时, Cy5-DNA很容易在血液中被清除, 其在血液中半衰期不到3 h. 单独使用阳离子载体PEI时, 虽然可以起到一定作用, 但其半衰期也只是略微的改善. 引入PPG之后, Cy5-DNA在血浆中的半衰期得到大幅度提升, 与单独的Cy5-DNA相比, 半衰期提高了近3倍. 由此可见, PPG的引入对于改善血药浓度有着至关重要的作用. 同时, 即使在PPG上引入碳酸钙或者磷酸钙纳米粒, 对Cy5-DNA在血浆中的半衰期影响不大.

Fig.6 Pharmacokinetics of Cy5-DNA, Cy5-DNA/PEI, Cy5-DNA/PEI/PPG, Cy5-DNA/PEI/PPG@CaCO3 and Cy5-DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2(A) and their half-life in blood(B)a. DNA; b. DNA/PEI-25000; c. DNA/PEI-25000/PPG; d. DNA/PEI-25000/PPG@CaCO3; e. DNA/PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2.

3 结 论

为了使阳离子基因载体更加适合体内应用, 并且不会影响其自身的转染效率, 本文设计开发了具有促进转染增强作用的遮蔽体系. 制备了阴离子聚合物PPG, 以此聚合物为模板分别生长碳酸钙和磷酸钙得到PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2, 并作为遮蔽体系, 用于遮蔽DNA/PEI. 由于PPG@CaCO3在酸性环境会释放出二氧化碳气体, 有利于涨破内涵体, 从而将基因物质运送到细胞内. 而DNA/PEI/PPG及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2体系无法在酸性环境中产生气体, 导致运送基因物质至细胞内的能力大大减弱. 通过细胞转染、 细胞内吞及激光共聚焦实验研究了载体被细胞内吞及细胞内运输的过程, 通过药代动力学实验验证了所设计的载体体系大大提高了基因物质的体内循环时间, 适合体内应用. 因此, 本文设计的遮蔽体系不仅解决了阳离子载体不适合体内应用的问题, 而且解决了在通常情况下, 阳离子载体加入遮蔽体系后转染性能大大降低的不利因素, 为阳离子基因载体的进一步应用提供了参考.