可双光子激发的聚集诱导发光光敏剂及其生物医学应用

武文博, 刘 斌

(新加坡国立大学, 化学工程与分子生物工程系, 新加坡 117585)

根据世界卫生组织统计, 近六分之一的死亡是由癌症造成的[1], 因此恶性肿瘤也被公认为是人类健康的三大杀手之一. 值得注意的是, 癌症死亡人数有一半来自亚洲. 因此, 中国“十三五”卫生与健康规划、 “十三五”国家基础研究专项规划和“十三五”卫生与健康科技创新专项规划都将肿瘤的治疗和早期诊断作为重点, 开发有效的癌症诊断技术和疗法是科学家们面临的重大挑战. 放疗、 化疗及手术切除等传统的癌症疗法对患者往往有较大的毒副作用或创伤, 而且有很强的局限性. 以肺癌为例, 大约80%的肺癌肿瘤无法通过手术切除治疗, 而且临床表明无法手术切除肿瘤的多数肺癌患者在传统的放化疗中获益也十分有限[2]. 因此人们逐步将视线转移到包括光动力治疗(PDT)在内的一些新兴的局部疗法.

光动力治疗是通过光照激发富集在肿瘤部位的光敏剂(PS)产生的单线态氧(1O2)或其它活性氧(ROS)作为“药”来破坏生物大分子, 从而实现对癌细胞的选择性杀伤[3～7]. 与传统疗法相比, 光动力治疗的优势在于创伤小、 药物毒性低、 选择性好、 适用范围广、 无耐药性、 副作用小及可姑息治疗等[3,4]. 在临床上, 光动力治疗已经被用于治疗口腔癌、 食管癌、 膀胱癌及直肠癌等.

光敏剂的效率是光动力治疗疗效的决定性因素. 目前常用的光敏剂包括卟啉类化合物[8]、 吩噻嗪鎓类化合物[9]、 氟硼荧类化合物[10]、 花菁类化合物[11]及重金属配合物[12]等. 这些传统光敏剂的特点是: 虽然它们在单分子状态下均具有较强的荧光发射和光敏效应, 但它们的疏水性使其在水中或生理条件下以聚集态形式存在, 荧光发射和光敏效应均会大幅度降低, 甚至完全猝灭[13][以苝为例, 图1(A)], 进而影响光动力治疗的效果. 针对聚集导致猝灭(ACQ)的问题, Liu等[14]和Zhang等[15]分别研制了具有聚集诱导发光(AIE)效应的光敏剂. Tang等[16]发现聚集诱导发光效应, 是指荧光生色团在单分子状态下微弱发光甚至不发光, 而在固态或聚集状态下荧光显著增强的一种光物理现象[以六苯基噻咯为例, 图1(B)][17～19]. 研究结果表明, AIE光敏剂在聚集状态下依然可以保持较高的荧光量子产率和光敏效应[20～25]. Tang等[26]和Wang等[27]还发现一些特殊的AIE光敏剂, 它们在溶液状态下完全没有光敏能力, 而在聚集状态下单线态氧产生效率非常高. 在生理条件下, 疏水性的光敏剂通常以聚集态形式存在, 因而这类AIE光敏剂在实际应用中更具优势.

Fig.1 Fluorescent photos of solutions or suspensions of perylene(ACQ fluorophore, A) and hexaphenylsilole(AIE fluorophore, B) in THF/water mixtures with different volume fractions of water under UV lampReproduced with permission from Ref.[17], Copyright 2015, American Chemical Society.

AIE光敏剂也存在不足之处. 与传统的光敏剂相比, 绝大多数AIE光敏剂的吸收和发射均处于短波长区域. 目前, 大多数AIE光敏剂的吸收峰均在300～500 nm之间, 发射峰在600～700 nm之间, 这使其在进行光动力治疗时, 穿透深度并不高[28]. 双光子激发(TPE)是使用长波长光源激发吸收波长较短的分子的一种常用手段, 它是指以高强度激光(通常是飞秒脉冲激光器)照射待激发分子时, 待激发分子同时吸收2个长波长光子从而到达激发态的过程[29,30]. 而双光子光动力治疗则是一种利用双光子激发的手段, 通过近红外激光来激发光敏剂产生活性氧, 进而杀伤癌细胞的治疗方法[31,32]. 其最大的优势就是将激发波长红移到了近红外区域, 可大大提高光动力治疗时的穿透深度[33～35](图2). 同时, 由于双光子激发需要极高的能量密度, 导致只有处于激光焦点的光敏剂可以被顺利激发, 因此可以大幅度提高光动力治疗时的精准度[36,37](图2). 可见, 基于AIE光敏剂的双光子光动力治疗可以有效结合AIE光敏剂光敏性能好和双光子激发穿透深度深、 精准度高的优势. 因此, Liu等[38]和Chao等[39]在2017年初分别独立开发了基于AIE光敏剂的双光子光动力疗法. 这一新兴领域在2年多时间内获得了长足的进步. 本文将基于可双光子激发的AIE光敏剂的设计及在光动力治疗中的应用, 讨论这一领域最新的进展.

Fig.2 Difference between one-photon excited and two-photon excited photodynamic therapyReproduced with permission from Ref.[35], Copyright 2018, Royal Society of Chemistry.

1 可双光子激发的AIE光敏剂的设计

1.1 可双光子激发的AIE光敏剂的基本理论

Fig.3 Simplified Jablonski diagram depicting the electron transitions of different types of PSs upon light excitation(A) Traditional PS; (B) AIE PS in aggregated state. ISC from S1 to T1, and energy transfer from T1 to 3O2, generating cytotoxic 1O2. ISC: intersystem crossing, NR: nonradiative decay, FL: fluorescence, 1O2: singlet oxygen, 3O2: normal oxygen. Reproduced with permission from Ref.[20], Copyright 2016, Wiley-VCH.

根据文献[40]报道, 单线态氧是在光动力治疗中对癌细胞杀伤效果最好的活性氧之一, 因此, 我们以单线态氧的产生过程为例介绍光敏剂的工作原理[图3(A)]. 在合适波长的激发光照射下, 光敏剂从基态激发到激发态. 根据Kasha规则[41], 最低单重激发态(S1)是与后续的光物理过程密切相关的. 若S1态与最低三重激发态(T1)之间的能级差(ΔES-T)足够小(通常需要小于0.3 eV)[42], 激子即可通过系间窜越(ISC)的过程, 从S1态跃迁到T1态. 由于激子从T1态到基态的过程是量子力学禁阻的, 因此T1态往往具有比较长的寿命(通常为几微秒到几秒), 这就使得其有充足的时间与周围的氧气发生相互作用, 进而将氧气激发, 形成单线态氧, 实现光动力治疗. 对于传统的光敏剂, 一旦形成聚集态, 其分子间的π-π相互作用就会使得处于激发态的光敏剂通过非辐射跃迁(NR)而返回基态, 导致其荧光亮度和光敏活性降低. AIE光敏剂则有所不同. 分子内运动受限(RIM)被认为是绝大多数AIE分子的机理[43]. 在聚集状态下, 由于相邻分子的空间位阻效应, 分子内的运动由于具有较大的能量势垒而受限, 从而大幅降低了非辐射跃迁, 使得同时提高其荧光亮度和光敏效率成为可能[图3(B)]. 因此, 提高AIE光敏剂从S1态到T1态的系间窜越是提高其敏化效率的关键. 目前, 最广泛使用的设计方案是通过降低分子给体与受体之间的共轭来实现分子最高已占分子轨道(HOMO)和最低未占分子轨道(LUMO)的分离, 进而降低分子的ΔES-T值来提高其系间窜越[20,26,44,45].

若要实现基于AIE光敏剂的双光子光动力治疗, 除了要提高AIE光敏剂的光敏效应, 其双光子吸收截面则是另外一个需要考虑的因素. 自1961年双光子吸收现象被首次报道以来[46], 经过50余年的发展, 与双光子吸收相关的理论和技术已经非常成熟. 2008年, Prasad等[47]总结了一些较为通用的结论: (1) 有机分子的共轭越好, 有效共轭长度越长, 其双光子吸收截面越高; (2) 在一定强度的范围内, 给体-受体越强, 其双光子吸收截面越高; (3) 分子的平面性越好, 对称性越高, 双光子吸收性能也会越好; (4) 由于协同增强效应, 枝状结构有利于提高双光子吸收截面. 可见, 这与AIE光敏剂的设计理念存在一些冲突. AIE光敏剂的设计需要降低分子给体-受体之间的共轭, 而提高双光子吸收截面则需要改善其共轭; AIE光敏剂需要分子出现一定的扭曲, 而提高双光子吸收则需要分子尽可能保持平面. 因此, 尽管在理论上基于AIE光敏剂的双光子光动力治疗具有诸多优势, 但也直到近几年才出现相关报道. 为了避免这些矛盾, 科学家们做了许多探索和尝试, 以期设计并制备光敏效应和双光子吸收截面兼备的AIE光敏剂.

1.2 通过给体-受体精准调控设计可双光子激发的AIE光敏剂

Fig.4 Design and properties of TPEDC(A) Chemical structure, HOMO and LUMO distributions of TPEDC; (B) UV-Vis spectra of ABDA in the presence of TPEDC NPs under light irradiation(60 mW/cm2, 400—700 nm) in water; (C) two-photon absorption cross section of TPEDC NPs at different wavelengths, the inset shows the two-photon-induced fluorescence spectrum; (D, E) detection of intracellular ROS generation using DCF-DA in HeLa cells incubated with(E) and without(D, control) TPEDC NPs followed by different two-photon scans, λex=488 nm; λem=505—525 nm. Fig.(A) was reproduced with permission from Ref.[45], Copyright 2017, Wiley-VCH; Figures(B—E) were reproduced with permission from Ref.[38], Copyright 2017, Wiley-VCH.

给体和受体的结构及二者之间的共轭是实现光敏效应和双光子吸收截面的关键. 光敏效应需要适当降低二者之间的共轭以实现HOMO-LUMO的更好分离, 而提高双光子吸收截面则需要更好的共轭. 因此, 如果能对给体、 受体及共轭桥进行精准调控, 理论上能够制备双光子激发的AIE光敏剂, 这也是我们最初的设计理念. 我们[38]首先选取了具有AIE性质的含双甲氧基取代的四苯乙烯作为给体单元, 确保所得到光敏剂具有AIE效应. 对受体单元和共轭桥进行筛选, 发现以丙二腈为受体单元, 苯环为共轭桥时, 得到的TPEDC[图4(A)] 可满足双光子光动力的所有要求. 由图4(A)可见, TPEDC的HOMO和LUMO几乎没有重叠, ΔES-T仅为0.23 eV. 因此, 使用两亲性聚合物包覆TPEDC所形成的纳米颗粒(NPs)在水中具有非常良好的单线态氧产生效率. 9,10-蒽二基-双(亚甲基)二甲酸(ABDA)是一个常用的单线态氧指示剂. 通过其吸收变化[图4(B)]可以计算出, 在白光照射下(60 mW/cm2, 400～700 nm), TPEDC消耗ABDA的速率为5.5 min-1, 其效率远高于常用的卟啉类光敏剂Ce6. 同时, 该纳米颗粒具有良好的双光子吸收性能, 其在850 nm处的双光子吸收截面可达3500 GM[图4(C)](基于纳米颗粒的测试结果会远大于基于分子的测试结果, 因此二者不具备可比性, 应考虑测试条件). 我们在细胞中验证了TPEDC纳米颗粒在双光子激发下产生单线态氧的能力. 二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)在细胞中被酯酶水解, 随后遇到活性氧即可发射出明亮的绿光, 因此可作为活性氧的指示剂使用. 在用双光子激发经TPEDC纳米颗粒和DCF-DA处理过的海拉细胞后, 可以在激光共聚焦显微镜下看到明亮的绿光[图4(D, E)], 证明TPEDC在双光子激发下的高效光敏活性.

Tang等[48,49]对这种设计方法进行了改进. 与四苯乙烯类似, 三苯胺也是一个富电子的芳基单元, 同样可以作为电子给体来设计光敏剂. 同时, 三苯胺也被证实是一个具有较大双光子吸收截面的结构单元[49～51]. 最近的研究表明, 将三苯胺与合适的受体单元以单键链接后, 产物高概率会表现出AIE特性[48,49]. 因此, 用三苯胺单元作为给体替换AIE光敏剂中的四苯乙烯单元, 有望在保持其AIE特性的基础上同时提高其光敏性能和双光子吸收截面. 基于此, Tang等[35]设计了AIE光敏剂IQ-TPA[图5(A)], 以二氯荧光素(DCFH)为指示剂的活性氧测试结果表明, 将给体替换为三苯胺后, IQ-TPA在单光子激发下的光敏能力较TPE-IQ-2O有了明显提升[图5(B)]. 同时, 三苯胺单元的引入, 使IQ-TPA具有良好的双光子吸收, 其分子双光子吸收截面在900 nm处达到最大, 为215 GM[图5(C)].

Fig.5 Design and properties of IQ-TPA(A) Chemical structures of TPE-IQ-2O and IQ-TPA; (B) change in fluorescence intensity at 525 nm of TPE-IQ-2O/IQ-TPA and DCFH in PBS upon white light irradiation for different times; (C) two-photon absorption spectrum of IQ-TPA.Reproduced with permission from Ref.[35], Copyright 2018, Royal Society of Chemistry.

随后, Tang等[52]利用这种设计理念, 设计了另一个可双光子激发的AIE光敏剂DCDPP-2TPA[图6(A)]. DCDPP-2TPA以二腈基吡嗪受体为核, 2个三苯胺给体单元为枝, 苯环为共轭桥, 形成V型的D-π-A-π-D结构. 这些结构特征均符合有机分子双光子吸收截面的要求. 因此, 根据图6(A)制备含DCDPP-2TPA的纳米颗粒以增强其水溶性后, DCDPP-2TPA纳米颗粒在水溶液中表现出非常好的双光子吸收性能, 其在1040 nm处的双光子吸收截面达到了3.28×106GM, 远高于前述其它AIE光敏剂, 但该分子的光敏性能一般. 经450 nm蓝色激光照射25 min后, 16 ng光敏剂纳米颗粒仅能消耗约20 ng ABDA. 因此, 在细胞实验中, 虽然DCDPP-2TPA 纳米颗粒经双光子激发可以产生活性氧[图6(B)], 但效率并不高. 这也证明了同时提高AIE光敏剂的光敏效应和双光子吸收截面是比较困难的.

Fig.6 Design and properties of DCDPP nanoparticles (A) Preparation of DCDPP-2TPA-encapsulated silica nanoparticles; (B) two-photon fluorescence imaging of HeLa cells after irradiation for 5 min with a 1040 nm fs laser pretreated with DCDPP-2TPA-encapsulated silica NPs(0.018 mg/mL) and DCF-DA(25 μmol/L), or only DCF-DA(25 μmol/L).Reproduced with permission from Ref.[52], Copyright 2018, Wiley-VCH.

1.3 通过重金属配合物设计可双光子激发的AIE光敏剂

最近, Chao等[39,53]提出了设计可双光子激发的AIE光敏剂的另一个思路. Chao等[54,55]发现以咪唑作为配体的铱配合物具有较好的双光子吸收性质. 而重金属配合物往往或多或少都具备一些光敏性能[12], 在此基础上, 将苯环通过单键引入这类铱配合物中以提供“转子”来赋予其AIE特性, Chao等[53]制备了可双光子激发的AIE光敏剂Ir1和Ir2 [图7(A)]. 随后, Chao等[39]将具有AIE性能的双光子吸收基团三苯胺以单键链接到配体上, 制备了Ir3, Ir4和Ir5, 进一步提高了其双光子吸收截面. 其中, Ir3的性能最优, 处于分子状态时, 其在730 nm处的双光子吸收截面达到了214 GM, 而且无论荧光亮度还是单线态氧产生效率在聚集状态下均有大幅提升[图7(B～D)]. 目前, 对可双光子激发的金属配合物AIE光敏剂的研究还仅限于上述工作, 其中最主要的原因就是金属配合物的潜在毒性问题. 以Ir3为例, 在不加任何光源的前提下, 其对海拉细胞的半抑制浓度(IC50)为(38.6±1.7) μmol/L, 只比顺铂(28.8±2.3)略高[39], 导致以这些金属配合物为光敏剂进行光动力治疗时, 存在很强的毒副作用. 但这种设计思路为后续设计可双光子激发的AIE光敏剂提供了有益借鉴.

Fig.7 Design and properties of Ir1—Ir5(A) Chemical structures of Ir1—Ir5; (B) Trajectory of Ir3 emission intensity versus water fraction and visual observation of PL; (C) TPA cross-sections of Ir3; (D) 1O2 emission spectra in the presence of Ir3 and irradiation(405 nm laser) in varying fractions of water-DMSO mixture.Reproduced with permission from Ref.[38], Copyright 2018, Royal Society of Chemistry.

1.4 通过“聚合增强双光子光敏”概念设计可双光子激发的AIE光敏剂

研究表明, 制备可双光子激发的AIE光敏剂需要非常精确的分子设计. 目前主要还是通过HOMO-LUMO分离来提高AIE分子的光敏效应, 而这在某种程度上并不利于提高其双光子吸收. 因此, 寻找提高光敏效应的其它方法就显得十分必要. 2018年, Liu等[56,57]提出了“聚合增强光敏(Polymerization-enhanced photosensitization)”的概念. 与相似的小分子光敏剂相比, 共轭聚合物(CP)在光照下往往会具有更高的单线态氧产生能力. 其原因在于, 随着聚合度的提高, 光敏剂的激发态之间的能级差逐渐接近, 使得单重激发态至三重激发态的系间窜越有了更多可行的途径, 进而提高其单线态氧产生效率. 同年, Tang等[58]也报道了类似现象. 共轭聚合物最大的特征就是其π共轭骨架, 而较大的共轭结构对双光子吸收十分有利[47,59]. 基于此, Liu等[60]设计并合成了与TPEDC结构类似的共轭聚合物PTPEDC1, 随后又改变了其共轭链接方式制备了PTPEDC2, 以进一步提高其共轭程度[图8(A)]. 将这些光敏剂用两亲性聚合物包覆后, 可制备具有良好水分散性的纳米颗粒. 在基本不影响吸收与发射的前提下[图8(B)], 共轭聚合物PTPEDC1纳米颗粒的光敏性能提高至小分子光敏剂TPEDC纳米颗粒的2.27倍[图8(C)], 而其双光子吸收截面提高到了TPEDC纳米颗粒的3.15倍[图8(D)]. 当其共轭程度进一步改善后, PTPEDC2纳米颗粒的光敏性能和双光子吸收截面分别提高至TPEDC纳米颗粒的5.48倍和6.15倍. 通过图9(A)所示的装置, 以二氯荧光素为指示剂, 直接测试了这些AIE光敏剂纳米颗粒在双光子激发下的光敏性质[图9(B)][60]. 由图9(B)可以看出, 在相同条件下, PTPEDC2表现出比小分子光敏剂TPEDC及临床上常用的光敏剂Ce6强得多的双光子光敏性能. 这种设计理念被命名为“聚合增强双光子光敏”(polymerization-enhanced two-photon photosensitization)[60], 为后续设计新型可双光子激发的AIE光敏剂提供了一种全新的思路.

Fig.8 Design and properties of PTPEDC2(A) Chemical structures of TPEDC, PTPEDC1 and PTPEDC2; (B) normalized absorption and photoluminescence(PL) spectra of AIE PS NPs in aqueous media; (C) normalized degradation percentages of ABDA in the presence of PS NPs in aqueous media upon white light irradiation(400—700 nm, 50 mW/cm2); [AIE PS NPs]=10 μmol/L based on AIE PS; [ABDA]=50 μmol/L; (D) two-photon absorption cross-section spectra of AIE PS NPs in aqueous solution.Reproduced with permission from Ref.[60], Copyright 2019, American Chemical Society.

Fig.9 Schematic illustration for the in vitro ROS detection of AIE PS NPs in aqueous media under two-photon excitation(A) and in vitro real-time detection of ROS generation in aqueous solution of PS NPs under two-photon excitation after different scans(B)The image in the last column is the overlay image between the 1th and 5th columns. λex=820 nm, λem: 635—675 nm(red, from PS NPs) and 510—535 nm(green, from DCFH), scanning laser: 820 nm, 6 mW, 5.33 s per scan. Reproduced with permission from Ref.[60], Copyright 2019, American Chemical Society.

2 可双光子激发的AIE光敏剂的生物医学应用

2.1 双光子光动力细胞消融

光敏剂在生物医学中最大的应用就是光动力治疗, 这也是最初设计可双光子激发的AIE光敏剂的目的. 在可双光子激发的AIE光敏剂诞生之初, Liu等[37]以TPEDC为光敏剂, 验证了其在癌细胞的双光子光动力杀伤中的应用. 活/死细胞染色试剂盒经常被用于表征药物对细胞的杀伤情况. 其中, 钙黄素(Calcein)是一种可对活细胞进行荧光标记的优良染色试剂, 当其存在于活细胞内时, 可在细胞内无所不在的脂酶作用下, 发射出明亮的绿色荧光. 而碘化丙啶(Propidium iodide)可以进入受损的细胞, 与核酸结合, 产生明亮的红色荧光信号. 由图10(A)可见, 在TPEDC存在的前提下, 随着双光子扫描次数的增多, 代表活细胞的绿色荧光逐渐减少, 而代表死细胞的红色荧光逐渐增多, 证明了基于TPEDC的双光子光动力对癌细胞的杀伤十分有效. 定量数据表明, 当TPEDC的浓度为10 μg/mL, 激光功率为20 mW时, 通过20次扫描即可杀死50%的海拉细胞. 另外, 由于双光子吸收对激发光能量要求较高, 因此双光子光动力现象只能在激发光的焦点上观察到, 即图10(A)中的白框区域. 而对于单光子光动力, 光敏剂将会对所有经光照射处产生破坏[图10(B)][61], 表明双光子光动力治疗具有比单光子光动力治疗高得多的精准度.

光动力治疗时, 将光敏剂靶向至细胞内的关键细胞器可以改进疗效, 其原因在于单线态氧的寿命很短(在水中的半衰期仅为3.1 μs), 在生理条件下作用距离十分有限[62], 因此将光敏剂靶向至关键细胞器后可显著提高其产生的单线态氧对细胞器的破坏力. 线粒体负责为整个细胞的正常生理活动提供能量, 而基于具有线粒体靶向功能的光敏剂的光动力治疗也被证实是最有效杀伤细胞的光动力策略之一. 大多数癌细胞具有更高的线粒体膜电位, 因此许多阳离子化合物均可以在癌细胞的线粒体中富集[63]. IQ-TPA和铱配合物(Ir1～Ir5)均带有正电荷, 可以实现线粒体靶向. 因此, 这些光敏剂也被利用来实现线粒体靶向的癌细胞双光子光动力杀伤[35,39,53]. 由于IQ-TPA本身在双光子激发时能发射橙红色的荧光(发射峰为622 nm), 因此可以在进行双光子光动力的同时, 利用其双光子荧光对癌细胞线粒体进行成像, 通过监测线粒体的变化以监控整个双光子光动力过程[35]. 由图11可见, 随着双光子扫描次数的增加, 本来是网状的线粒体结构逐渐碎成了颗粒状, 证明了双光子光动力对线粒体的破坏. 定量结果也证明IQ-TPA在双光子激发下对癌细胞的光动力杀伤: 当IQ-TPA的浓度为1 μmol/L, 激光功率为20 mW时, 14次扫描即可杀死50%的海拉细胞, 明显优于TPEDC纳米颗粒的结果.

Fig.11 Monitoring the mitochondrial change during two-photon PDT by the fluorescence of IQ-TPAFluorescence images of HeLa cells were incubated with 1 mmol/L of IQ-TPA for 30 min and then followed by two-photon scans: (A, A′) 1 scan, (B, B′) 33 scans, (C, C′) 66 scans, (D, D′) 100 scans. The two-photon excitation condition was at 900 nm(fs Ti: sapphire laser, 5 mW) with a scan area of 60 mm×60 mm and a scan speed of 1.02 s per scan.Reproduced with permission from Ref.[35], Copyright 2018, Royal Society of Chemistry.

Fig.12 Chemical structures of TPE-red and PSMA as well as the preparation of AIE-PSMA NPs(A) and transmission images of HeLa cells with different treatment(B)Reproduced with permission from Ref.[65], Copyright 2017, Royal Society of Chemistry.

光子在近红外二区(NIR-Ⅱ, 1000～1700 nm)表现出比在可见光区域和近红外一区(NIR-Ⅰ, 700～900 nm)更高的穿透能力及更低的组织吸收和散射[64]. 因此, 利用近红外二区的激光来激发AIE光敏剂进行双光子光动力理论上也更有优势. Qian等[65]选取2014年由Zhang等[15]开发的AIE光敏剂TPE-red[图12(A)], 证实了其在近红外二区具有一定的双光子吸收性质, 并测试了其在1040 nm 处的双光子吸收截面为27.7 GM. 将TPE-red以两亲性的PSMA包覆后, 可以制备成具有良好水分散性的纳米颗粒AIE-PSMA. Qian等以海拉乳腺癌细胞为模型验证了AIE-PSMA在1040 nm飞秒激光激发下的双光子光动力效果. 随着激光照射时间的延长, AIE-PSMA使海拉细胞的形态发生了明显变化(变圆), 甚至坏死. 而在不含光敏剂或不进行双光子激发的对照组, 其细胞的形貌基本没有变化[图12(B)]. 半定量结果表明, 在光敏剂AIE-PSMA纳米颗粒的浓度为20 μg/mL的前提下, 1040 nm飞秒激光(60 mW)照射2 min可以杀伤大约90%的海拉细胞.

2.2 双光子光动力肿瘤治疗

2019年, Liu等[60]首次将基于AIE光敏剂的双光子光动力应用于治疗活体内的实体瘤. 使用米非司酮和苯基硫脲喂养斑马鱼幼苗, 以诱发斑马鱼的肝脏产生癌变, 建立斑马鱼幼苗的肝癌模型, 并基于“聚合增强双光子光敏”概念设计的PTPEDC2纳米颗粒为光敏剂来研究双光子光动力的疗效[图13(A)]. 将光敏剂PTPEDC2纳米颗粒通过静脉注射进斑马鱼幼苗后, 对PTPEDC2进行双光子成像, 观察到PTPEDC2纳米颗粒可通过实体瘤的高通透和滞留(EPR)效应在肿瘤部位富集, 且其在肿瘤部位的浓度在注射24 h后达到最高. 此时, 使用820 nm激光扫描肿瘤部位, 通过双光子技术激发光敏剂, 并监测肿瘤尺寸的改变[图13(B)]. 双光子光动力治疗24 h后, 肿瘤尺寸降低了大约20%, 而在其它3组对照组中, 肿瘤的尺寸均增长了约50%, 证实了基于AIE光敏剂的双光子光动力抗肿瘤治疗在活体上也十分有效.

Fig.13 Two-photon excited PDT results of in PTPEDC2 NPs in zebrafish liver tumor model (A) Schematic illustration of in vivo two-photon excited PDT of PTPEDC2 NPs in zebrafish liver tumor model; (B) the relative increase(in percent) in zebrafish tumor size after different treatments. N.S.: data are not significantly different; double asterisks indicate p<0.01, and n=6. Laser: 820 nm fs laser.Reproduced with permission from Ref.[60], Copyright 2019, American Chemical Society.

2.3 双光子光动力血管闭合

双光子光动力在活体应用的另一个模型就是光控血管闭合. 光动力诱发的血管闭合可导致闭合血管附近的肿瘤坏死, 从而达到治疗肿瘤的目的[66]. 当病灶部位在脑部及眼部等相对复杂的部位时, 具有高精准度的双光子激发手段对光控血管闭合就显得尤为重要[67]. Liu等[38]利用AIE光敏剂实现了小鼠脑部血管的双光子成像和双光子光动力血管闭合. 首先通过显微外科手术打开了小鼠的头骨, 然后以尾静脉注射的方法将TPEDC纳米颗粒(TPEDC用量为8 mg/kg)注入小鼠体内, 并利用TPEDC的双光子荧光对小鼠脑血管进行三维双光子荧光成像[图14(A～E)]. 在100 μm深处选取了直径为5 μm的动脉进行血管闭合实验. 经800 nm激光连续照射约4 min后, 扫描区域内血管的荧光几乎消失了, 表示血管闭合的成功[图14(F,G)]. 而作为对比, 当使用相同剂量不具备光敏性能的Luminicell纳米颗粒(商业化的一种AIE纳米颗粒, 已经被用于双光子成像)作为血管成像试剂时, 在同等条件下, 血管几乎不产生任何变化[图14(H,I)]. 证明图14(G)中血管的闭合确实是由双光子激发TPEDC纳米颗粒所产生的单线态氧造成的, 这也是基于AIE光敏剂的双光子光动力在活体层面上的又一成功案例.

Fig.14 Two-photon excited brain-blood-vessel closure results of TPEDC (A, B): 3D reconstruct(A) and Z-projection(B) of two-photon images of brain blood vessels. (C—E): Two-photon images of brain blood vessels at different vertical depths: 70 μm(C), 140 μm(D), and 200 μm(E). (F, G): Pre-irradiation(F) and post-irradiation(G) images of the brain blood vessels of mouse treated with TPEDC NPs(8 mg/kg based on TPEDC) and two-photon excitation. (H, I): Pre-irradiation(H) and post-irradiation(I) images of the brain blood vessels of a mouse treated with Luminicell NPs and two-photon excitation. The scanned areas are highlighted by white squares. Two-photon excitation condition: 800 nm, 30 mW; λex: 800 nm; λem: 590—630 nm.Reproduced with permission from Ref.[38], Copyright 2017, Wiley-VCH.

3 总结与展望

自从AIE光敏剂的双光子光动力治疗被报道以来, 其在光动力治疗领域已经显示出疗效好及精准度高等优势, 因而获得了多方关注. 兼具较大的双光子吸收截面和较高的单线态氧产生效率的AIE光敏剂是此领域发展的关键. 目前, 此类光敏剂大多是通过对给体和受体的精准调控来设计的, 难度相对较高. 聚合增强双光子光敏效应为设计可双光子激发的AIE光敏剂提供了一条捷径, 基于此思想, 后续可以开发出性能更加优异的光敏剂. 此外, 该领域属于全新领域, 科学家们目前主要是在溶液中和细胞层面上研究其相关性质, 而对其在活体动物上的验证还有所欠缺. 目前, 也仅有两例工作与活体动物相关: 其一是在斑马鱼幼苗上实现了肝癌的治疗; 其二是在小鼠脑部血管实现了光控血管闭合. 因此设计性能优异的光敏剂, 并在活体动物上验证其双光子光动力的疗效, 将成为该领域内的研究重点. 由于双光子激发的效率问题, 其进行光动力治疗时的疗效往往要低于传统的单光子光动力治疗, 但其具有单光子激发所不具备的高精准度和穿透深度. 因此, 双光子技术更加适用于病灶部位在脑部和眼部等相对复杂部位的光动力治疗, 这也是将来双光子光动力甚至多光子光动力在临床转化时的方向.