基于萘普生-芳基金属配合物的抗癌及抗炎性能

薛旭玲, 陈 俊, 张自由, 王萌萌, 吕梦迪, 郝元元, 胡炯圣,葛 超, 苏 志, 钱 勇, 刘红科

(南京师范大学化学与材料科学学院, 南京 210023)

20世纪60年代, Rosenberg等[1]首次发现顺铂具有抑制肿瘤细胞增殖作用, 从此展开了铂配合物在生物活性方面的研究. 虽然铂类药物具有优异的抗癌活性, 但其毒副作用大、 细胞耐药性强等缺点也让研究者将目光投向了非铂类金属配合物. 近年来, 已出现多种非铂类抗肿瘤配合物, 如钌(Ru)、 铱(Ir)、 锇(Os)及铑(Rh)等金属配合物也表现出不同程度的抗癌活性[2～6]. 由Keppler等[7]研发的KP1019以及Alessio等[8～10]开发的NAMI-A已进入临床试验阶段. 这可能是由于配合物RuⅢ在体内被还原成RuⅡ, RuⅡ会与DNA结合并诱导癌细胞凋亡[11～14]. Sadler等[15～18]在钌、 铱及锇等非铂类配合物的抗癌研究方面做出了开创性工作, 并受到广泛关注. Dyson等[19～21]在芳基金属配合物用于抗肿瘤研究方面也做出了贡献. 研究[19]表明, 非铂类尤其是带有芳基的金属配合物具有与顺铂不同的作用靶点及抗癌机制, 在很大程度上克服了顺铂毒副作用大及耐药性强等缺点, 部分芳基金属配合物的抗癌活性与目前临床治疗效果最好的顺铂相当甚至超过顺铂. 目前, 该领域的研究热点包括发现抗肿瘤新靶点、 设计高效低毒抗肿瘤药物及靶向性药物等. 本课题组近年来一直致力于芳基金属(钌、 铱、 锇及铑等)配合物的合成及其在抗肿瘤方面的应用和机理研究, 提出了综合考虑抗癌机制与致癌机制相似性的理论雏形[22～24], 为抗癌化学疗法的研究提供了新的思路, 还通过改变配体上的取代基以调控金属配合物的抗癌活性[25～27].

除抗癌方面的研究外, 芳基金属配合物因其独特的半夹心结构而作为前驱体被广泛用于多核环状及笼状配合物的构建[28], 金国新等[29,30]以芳基金属配合物为构筑单元, 组装出多种具有特殊结构与功能的多核配合物, 实现了芳基金属配合物的结构多样化. 本课题组[31]选择具有抗癌、 抗菌等活性的天然产物甘草次酸为有机导向分子, 将其连接到芳基钌配合物上, 实现了2种芳基金属配合物良好的抗癌和抗菌性质.

研究[32]表明, 炎症与肿瘤的发生、 转移等过程密切相关, 并且持续性的炎性微环境可通过触发特定的基因突变来诱发肿瘤产生, 因此, 通过控制炎症达到治疗癌症的目的成为科学家们研究的重要方向[33]. 萘普生(NPX)作为一种临床用于解热镇痛的非甾体抗炎药及合成酶抑制剂, 主要用于治疗风湿性/类风湿性关节炎、 骨关节炎及强直性脊椎炎等疾病. 萘普生主要通过抑制前列腺素的合成而发挥抗炎镇痛作用, 即抑制COX-1和COX-2两种形式环氧酶的活性, 从而影响血管生成、 细胞凋亡、 细胞增殖和转移及炎症反应等生理过程[34]. Mandal等[35,36]将萘普生连接到铂(Ⅳ)、 芳基钌、 环金属钌和铼(Re)等金属配合物上, 实现了金属配合物抗癌和抗炎的双功能化应用.

本文通过桥联配体4-(4′-甲基-2,2′-联吡啶)-甲胺, 将萘普生连接到芳基金属配合物上, 不仅保留了萘普生的抗炎功能, 并通过结合具有生理活性的小分子实现了芳基金属配合物的多功能化应用. 此外, 通过紫外-可见吸收光谱比较了钌、 铱及锇3个配合物的水解能力, 利用圆二色谱和琼脂糖凝胶电泳研究了配合物与DNA的作用方式, 并初步探讨了3个配合物对几种肿瘤细胞株的抗癌活性.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

常用试剂和溶剂均来自南京师范大学危险品库; 芳基钌、 铱和锇二聚体、 萘普生购于希恩思生化科技有限公司; 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯丙三唑(HOBt)购于安耐吉化学试剂公司; 光谱测试所用溶剂购于Aldrich公司; 超纯水由Milli-Q纯水系统制备; 生物实验所用琼脂糖、 pBR322质粒、 小牛胸腺DNA、 溴化乙锭、 溴酚蓝及磷酸盐缓冲液等购于上海生物工程公司; 实验用细胞分别为宫颈癌细胞(Hela)、 人非小细胞肺癌细胞(A549)、 人卵巢癌细胞(A2780)和人急性早幼粒细胞白血病细胞(NB-4)购于美国模式菌种收集中心(ATCC).

核磁共振波谱在AVANCE 400型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)上采集; 元素分析由Vario EL Ⅲ型元素分析仪(德国Elementa公司)完成; 电喷雾质谱采用南京大学分析测试中心的电喷雾LCQFLEET质谱仪(美国Thermo公司)测定; 紫外-可见吸收光谱采用Lambda 365型分光光度计(美国Perkin Elmor公司)测试; 荧光光谱由F-4600型荧光分光光度计(日本日立公司)记录; 圆二色光谱(CD)信号采用Chriascan型圆二色谱仪(英国Applied Photophysics公司)测定. 琼脂糖凝胶电泳实验采用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪(北京市六一仪器厂), 并通过Bio-RAD ChemiDox XPS系统(美国Bio-Rad公司)成像.

1.2 实验过程

1.2.1 4-(4′-甲基-2,2′-联吡啶)-甲胺的合成 参照文献[37]方法合成4-(4′-甲基-2,2′-联吡啶)-甲胺. 在氩气气氛下, 将4.4 g SeO2(39.8 mmol)与5.2 g 4,4′-二甲基-2,2′-联吡啶(28.5 mmol)加入到300 mL 1,4-二氧六环溶液中, 回流反应24 h后, 趁热过滤, 减压除去溶剂. 加入50 mL饱和NaHCO3溶液, 用CH2Cl2萃取, 减压除去溶剂. 然后, 向体系中加入0.3 mol/L Na2S2O5溶液, 搅拌30 min后, 减压抽滤, 滤液用Na2CO3调节pH≈10, 用CH2Cl2萃取, 合并有机相, 减压除去溶剂, 经真空干燥得到白色固体产物4-甲基-4′-甲醛-2,2′-联吡啶(产率为76%), 直接用于下一步反应.

将2.4 g 4-甲基-4′-甲醛-2,2′-联吡啶(12.1 mmol)、 3.0 g盐酸羟胺(43.2 mmol)和8.0 g K2CO3(57.9 mmol)溶解于甲醇/水混合溶液中, 于80 ℃回流反应1 h, 冷却至室温后加入冰水, 得到白色固体沉淀, 过滤, 用水洗涤经真空干燥得白色固体产物4-甲基-4′-甲醛肟-2,2′-联吡啶(产率为85%), 直接用于下一步反应.

将2.1 g 4-甲基-4′-甲醛肟-2,2′-联吡啶(9.8 mmol)、 1.9 g CH3COONH4(25 mmol)及30 mL氨水溶解于乙醇/水混合溶液中, 加热回流反应30 min, 再加入2.8 g Zn粉(50 mmol), 继续反应3 h, 冷却至室温, 过滤, 减压除去溶剂, 加入NaOH, 有白色固体析出, 用CH2Cl2萃取, 合并有机相, 减压除去溶剂, 经真空干燥得产物4-甲基-4′-甲胺-2,2′-联吡啶(产率为83%).1H NMR(400 Hz, CDCl3),δ: 8.60(d, 1H,), 8.52(d, 1H), 8.32(s, 1H), 8.23(s, 1H), 7.30(d, 1H), 7.15(d, 1H), 4.02(s, 2H), 2.48(s, 3H).

1.2.2 配体NPX-bpy的合成 在氩气气氛下, 将0.58 g萘普生(2.5 mmol)、 0.58 g EDCI(3.0 mmol)、 0.41 g HOBt(3.0 mmol)及0.60 g的4-(4′-甲基-2,2′-联吡啶)-甲胺(3.0 mmol)溶解于20 mL 二甲基甲酰胺中, 室温下搅拌5 h, 用薄层层析法(TLC)跟踪反应至结束. 向反应体系中加入适量水, 有大量白色沉淀生成, 减压抽滤得到粗产物, 经柱层析分离纯化(洗脱剂CH2Cl2/CH3OH体积比为30∶1), 即得0.65 g较纯的配体NPX-bpy, 产率65%.1H NMR(400 MHz, CDCl3),δ: 8.50(dd,J=17.8, 5.0 Hz, 2H), 8.18(s, 2H), 7.82～7.57(m, 3H), 7.42(dd,J=8.5, 1.8 Hz, 1H), 7.13(ddd,J=10.8, 6.8, 2.4 Hz, 3H), 7.06(dt,J=5.4, 2.7 Hz, 1H), 5.93(t,J=5.5 Hz, 1H), 4.46(d,J=6.1 Hz, 2H), 3.91(s, 3H), 3.85～3.76(m, 1H), 2.43(d,J=3.7 Hz, 3H), 1.64(d,J=7.2 Hz, 3H). ESI-MS(+),m/z: 理论值 412.50; 实验值 412.42.

1.2.3 配合物[Ru(η6-p-cymene)(NPX-bpy)Cl]Cl(1)的合成 将41.2 mg NPX-bpy配体(0.1 mmol)加入到20 mL含30.6 mg Ru2(η6-p-cym)2Cl4(0.05 mmol)的CH3OH溶液中, 常温下搅拌反应24 h后, 将溶液减压浓缩至近饱和状态, 加入适量乙醚, 离心即得相应的芳基钌配合物1, 产率84.0%. RuC36H39N3O2Cl2(H2O)2元素分析(%), 理论值: C 57.37, H 5.75, N 5.58; 实验值: C 56.59, H 5.55, N 5.55.1H NMR(600 MHz, CDCl3),δ: 9.21(s, 1H), 9.05～8.96(m, 1H), 8.95～8.84(m, 1H), 8.62(d,J=6.7 Hz, 1H), 8.25(d,J=25.1 Hz, 1H), 7.89(d,J=12.3 Hz, 1H), 7.70～7.58(m, 3H), 7.48～7.39(m, 1H), 7.30(s, 1H), 7.03(d,J=5.7 Hz, 2H), 6.05(d,J=5.2 Hz, 1H), 5.94(d,J=4.3 Hz, 1H), 5.89(s, 1H), 5.76(d,J=5.8 Hz, 2H), 4.54(s, 3H), 4.24(m,J=13.7, 6.9 Hz, 1H), 3.87(d,J=1.5 Hz, 3H), 3.47(q,J=7.0 Hz, 2H), 2.47～2.38(m, 3H), 2.21(d,J=12.7 Hz, 3H), 1.56(dd,J=10.5, 7.0 Hz, 3H). ESI-MS(+),m/z: 理论值: 682.24[1-Cl-]+, 实验值: 682.50[1-Cl-]+.

1.2.4 配合物[Os(η6-p-cymene)(NPX-bpy)Cl]Cl(2)的合成 将82.0 mg配体NPX-bpy(0.2 mmol)加入到30 mL含80.0 mg Os2(η6-p-cym)2Cl4(0.1 mmol)的CH3OH溶液中, 常温下搅拌反应48 h后, 将溶液浓缩至近饱和状态, 加入乙醚, 析出沉淀, 分别用丙酮和乙醚洗涤沉淀3次, 离心, 经真空干燥得芳基金属锇配合物2. 基于所消耗的Os(Ⅱ)二聚体的量, 收集浅黄色产物, 产率为82.3%. OsC36H39N3O2Cl2·(H2O)2元素分析(%), 理论值: C 51.35, H 5.15, N 4.99; 实验值: C 50.92, H 4.95, N 4.99.1H NMR(400 MHz, CDCl3),δ: 9.57(d,J=6.0 Hz, 1H), 9.06(s, 1H), 8.95(dd,J=12.2, 4.9 Hz, 1H), 8.75(d,J=17.3 Hz, 1H), 8.28(s, 1H), 7.91(d,J=8.5 Hz, 1H), 7.66(ddd,J=27.2, 12.9, 5.2 Hz, 3H), 7.39(dd,J=11.6, 5.4 Hz, 1H), 7.02(d,J=5.3 Hz, 2H), 6.00～5.87(m, 2H), 5.78(d,J=4.6 Hz, 2H), 4.53(d,J=5.3 Hz, 2H), 4.28(m,J=13.1, 6.5 Hz, 1H), 3.86(s, 3H), 2.42(dd,J=10.3, 2.3 Hz, 3H), 2.21(d,J=8.1 Hz, 3H), 1.57(t,J=6.8 Hz, 3H). ESI-MS(+),m/z: 理论值: 771.40[2-Cl-]+, 实验值: 772.50[2-Cl-]+.

1.2.5 配合物[Ir(η5-Cp*)(NPX-bpy)Cl]Cl(3)的合成 将41.2 mg NPX-bpy配体(0.1 mmol)加入到15 mL含39.8 mg Ir2(η5-C5Me5)2Cl4(0.05 mmol)的CH3OH溶液中, 常温下搅拌反应24 h后, 将溶液浓缩至近饱和状态, 加入乙醚, 析出沉淀, 分别用二氯甲烷、 丙酮和乙醚各洗涤3次, 经离心得到芳基金属铱配合物3. 基于所消耗的Ir(Ⅱ)二聚体的量, 收集浅黄色产物, 产率为81.4%. IrC36H40N3O2Cl2·(H2O)1.5·O2元素分析(%), 理论值: C 49.76, H 4.99, N 4.84; 实验值: C 49.58, H 4.97, N 4.83.1H NMR(400 MHz, DMSO),δ: 8.96(dd,J=13.1, 6.0 Hz, 1H), 8.86～8.71(m, 2H), 8.54(d,J=13.0 Hz, 1H), 8.40(d,J=22.8 Hz, 1H), 7.83～7.71(m, 3H), 7.67(d,J=5.8 Hz, 1H), 7.60～7.46(m, 2H), 7.27(d,J=2.3 Hz, 1H), 7.11(ddd,J=8.9, 2.5, 1.1 Hz, 1H), 4.54(s, 2H), 3.94(q,J=7.1 Hz, 1H), 3.86(d,J=1.0 Hz, 3H), 2.57(s, 3H), 1.68～1.55(m, 15H), 1.48(d,J=7.0 Hz, 3H). ESI-MS(+),m/z: 理论值: 774.39[3-Cl-]+; 实验值: 774.50[3-Cl-]+.

1.3 配合物的荧光光谱测定

分别将配合物1～3溶解在体积分数为5%的DMSO水溶液中, 确定溶液终浓度为50 μmol/L. 用荧光光谱仪测定溶液的发射光谱, 并以270 nm为激发波长, 测定3个配合物在450～800 nm的荧光光谱.

1.4 配合物的脂水分配系数测定

通过摇瓶法测定配合物的脂水分配系数. 将3个配合物分别溶于水相、 有机相(正辛醇)中, 恒温水浴条件下轻微振荡一定时间, 然后离心分离. 分别取上、 下层溶液用紫外-可见分光光度计检测水相与有机相中配合物的吸光度, 并进行计算. 脂水分配系数lgPO/W值通过配合物在有机相和水相中浓度的比值取对数获得.

1.5 配合物的水解实验

用紫外-可见光谱测定配合物1～3中离去基团(Cl-)的水解程度. 将配合物溶解在体积分数为5%的DMSO水溶液中, 确定配合物溶液的终浓度为50 μmol/L. 采用UV-Vis光谱测定配合物1～3的水解稳定性, 将比色皿置于双通道紫外分光光度计中, 扣除背景吸收, 于298 K下每15 min采集一组250～800 nm处的吸光度值数据, 共跟踪测试24 h.

1.6 配合物与CT-DNA 的相互作用分析

圆二色光谱(CD)是一种光学分析手段, 可用于研究DNA、 牛血清白蛋白(BSA)等手性分子随外界条件(如温度、 离子强度和pH)变化而导致的构象转变, 也是研究DNA与配合物相互作用的有力工具[38]. 用5 mmol/L磷酸盐(PBS)缓冲液配制一系列DNA碱基对浓度为100 μmol/L的储存液, 分别加入不同浓度的配合物, 配合物与碱基对的浓度比r(r=[complex]/[CT-DNA])分别为0, 0.05, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40. 将配合物与DNA于37 ℃水浴中共孵育24 h后进行测试, 测试温度298 K, 波长扫描范围200～600 nm, 扫描速度100 nm/min, 狭缝宽度1 nm.

此外, 琼脂糖凝胶电泳法也常用来检测配合物与DNA的结合. 用5 mmol/L PBS缓冲液配制一系列不同浓度比r(r=[complex]/[pBR322])的质粒DNA与3个配合物的反应液, 其中质粒DNA的浓度为10 μmol/L, 将反应液于37 ℃水浴中孵育24 h后, 向样品中加入6×loading buffer(体积分数0.05% 溴酚蓝+50%甘油+2 mmol/L Na2H2EDTA), 点样于0.8%琼脂糖凝胶中, 置于电泳缓冲液(40 mmol/L Tris-acetate+1 mmol/L EDTA, pH=8.3)中在70 mA恒定电流下电泳90 min, 用1.0 μg/mL溴化乙锭(EB)染色30 min, 凝胶成像系统分析得到电泳图像.

1.7 金属元素的细胞摄取实验

在6孔板中培养细胞, 待细胞密度达到80%后, 分别用配合物1～3孵育细胞24 h; 消化收集细胞加入1.5 mL离心管中, 于1000 r/min转速下离心4 min后弃去上层清液, 用PBS缓冲液洗涤细胞1次; 加入200 μL 细胞组织快速裂解液, 混合均匀后于4 ℃静置30 min, 待细胞充分裂解后于12000g转速离心10 min, 测定上层清液中蛋白浓度. 加500 μL 线粒体分离试剂, 轻轻悬浮细胞, 在冰浴中放置15 min; 把细胞悬液转移到匀浆器中, 匀浆20～30下; 将细胞液转移至1.5 mL离心管中, 在600g转速和4 ℃下离心10 min得到细胞核沉淀; 将上层清液转移至另一离心管中, 在12000g转速和4 ℃下离心10 min, 将上层清液转移至另一离心管中, 沉淀即为分离得到的细胞线粒体部分, 其余部分则为细胞质溶液. 向得到的细胞质、 细胞核及线粒体部分分别加入100 μL浓硝酸, 于95 ℃水浴中孵育2 h, 再加入50 μL 30% H2O2继续于95 ℃孵育1.5 h, 最后加入50 μL浓盐酸于70 ℃水浴中孵育至体积小于50 μL. 用超纯水将每管溶液体积补足至1 mL, 用ICP-MS光谱仪测定相应的Ru, Os及Ir等元素含量.

2 结果与讨论

2.1 配体和配合物的合成

配体和配合物的合成步骤如Scheme 1所示. 配体NPX-bpy由原料NPX与4-(4′-甲基-2,2′-联吡啶)-甲胺通过经典的酰胺化反应合成得到, 并经柱层析分离得到较纯的产物, 其1H NMR数据见本文支持信息图S1. 配合物的合成是通过配体与相应的Ru, Os及Ir二聚体以质量比2∶1的投料比在常温下搅拌反应, 并加入乙醚沉淀得到粗产品, 经重结晶后得到较纯的配合物1～3, 其1H NMR和ESI-MS结构表征数据见本文支持信息图S2～S7.

Scheme 1 Synthetic routes of target complexes 1—3

2.2 配合物的细胞毒性

通过噻唑蓝(MTT)方法以顺铂(CDDP)为阳性对照物测定了配合物1～3对细胞株HeLa, A549, A2780及NB-4的细胞毒性(IC50值, 见表1). 结果表明, 配体NPX-bpy对4种肿瘤细胞均无毒性(IC50>200 μmol/L), 并且配合物1～3对细胞HeLa, A549及A2780基本无毒性, 远远低于顺铂的毒性; 仅配合物1对白血病NB-4细胞具有中等强度的毒性(IC50=45.2 μmol/L), 且毒活性大于配合物2和3, 这可能与配合物1的水解性和在细胞核内分布较多有关.

Table 1 IC50(μmol/L) data of compounds against several cell lines in vitro

2.3 配合物的抗炎性能

环氧合酶(COX)是花生四烯酸代谢生成前列腺素过程的限速酶, 而前列腺素是产生炎症反应的主要诱因. COX有COX-1和COX-2两个亚型, 其中COX-2是一种诱导酶, 在组织损伤、 炎症等情况下表达增强. 巨噬细胞暴露在细菌产物中, 能诱导其发生显著的表性变化、 分泌大量的炎性因子和介质. 据文献[39]报道, NPX是一种COX-2抑制剂, 因此, 进一步研究了在4个浓度梯度下(10, 30, 50, 100 μmol/L)3个配合物对COX-2的体外活性抑制效果, 并与NPX作了对照, 结果如图2所示. 可见, NPX对COX-2有明显的抑制作用, 且随着其浓度的增加COX-2的抑制率明显增大, 这与文献[39]报道结果相符. 当配合物1～3与COX-2发生相互作用后, 3个配合物对COX-2的抑制作用类似于NPX, 且也与其作用浓度呈正相关性. 这说明经过芳基金属配位后的NPX衍生物也可以有效抑制COX-2的表达, 为新型的抗炎抗癌金属药物的开发提供了思路.

为了探究配合物1～3在抗癌、 抗炎等方面性能差异的原因, 进一步研究了配合物的荧光、 水解、 脂水分配系数、 配合物与 CT-DNA 的相互作用以及配合物的细胞摄取等性能.

Fig.2 Inhibition of COX-2 activity after treated with different concentrations of complexes 1—3

2.4 配合物的荧光性质

据文献[40]报道, NPX的发射波长为354 nm, 主要归因于分子中心电荷的π*-π转移. 以270 nm为激发波长, 测试了3种配合物的荧光光谱, 如图3所示, 配合物1～3的最大发射波长分别为545, 545和546 nm. 与NPX相比, 配合物的发射峰发生了大幅度红移, 这是由于金属到配体的MLCT(金属-配体电荷迁移)跃迁所致. 另外, 配合物的荧光强度大小顺序为配合物1>配合物2>配合物3, 与金属的d轨道电子在最高占有轨道(HOMO)的密度有关. 钌和锇属于同族元素, 具有相同的最外电子排布, 但是锇原子半径比钌的大; 而钌和铱属于同周期元素, 具有不同的最外层电子数排布, 因此可以解释配合物1的荧光强度与配合物2和3有明显不同[41].

2.5 配合物的脂水分配系数

配合物在脂水两相中具有不同的溶解度, 其吸光度采用UV-Vis光谱测定. 分别将配合物1～3在有机相与水相中于316与265 nm 处的吸光度相除, 然后取对数得到3种配合物的脂水分配系数lgPO/W分别为0.62, -0.25和0.43, 说明配合物1具有更高的亲脂性, 而配合物2亲水性更好, 亲脂性顺序为配合物1>配合物3>配合物2. Liu等[42]发现较好的亲脂性更有利于配合物透过细胞的磷脂双分子层, 提高药物的细胞摄取. 因此, 不同的亲脂性可能导致配合物的细胞毒活性不同.

2.6 配合物的水解性质

芳基金属配合物水解后可与DNA的碱基发生配位, 从而影响DNA的转录、 复制[43], 配合物的水解性质与其细胞摄取、 分布、 作用机制、 代谢和毒活性等药理学性质直接相关, 因此研究配合物的水解性能对理解配合物的性质非常重要. 图4为配合物1～3在298 K下24 h内每隔30 min的紫外光谱图, 可见配合物1的水解性质与配合物2和3完全不同. 配合物1更容易水解, 随着时间的变化, 吸收值上升, 其水解1/2所需的时间为42 min. 而配合物2和3在水溶液中相对稳定, 在24 h内几乎不发生水解, 这可能对金属配合物的抗肿瘤性能有一定影响.

2.7 配合物与 CT-DNA 的相互作用

圆二色光谱(CD)法常被用于研究DNA的构型变化, 也可用来判断DNA是否发生损伤. DNA的二级构象主要分为A型、 B型以及Z型, 其中CT-DNA采用B型构象. CT-DNA的CD光谱有一个正峰(275 nm)和一个负峰(245 nm), 其中, 正峰为DNA中碱基对的堆积作用, 负峰为双链DNA的双螺旋作用[44]. 采用CD光谱测定了配合物1～3对CT-DNA构型的影响, 结果如图5所示. 可见, 当未用配合物1～3孵育时(r=[complex]/[CT-DNA]值为0.0), CT-DNA的CD光谱有2个强度相同的特征峰, 分别是位于275 nm处的正峰和245 nm处的负峰. 加入配合物1和2后CD谱图的正峰强度随着配合物浓度的增加未见明显变化, 而CT-DNA的负峰强度则随着配合物浓度的增加均减弱, 且发生一定程度的红移. 对于配合物3, 275 nm处的正峰强度随着配合物浓度的增加略有降低, 负峰强度明显减弱. 这表明3个配合物的加入均可改变CT-DNA的螺旋构型, 从而使CT-DNA发生解旋.

Fig.4 UV-Vis spectra of complexes 1(A), 2(B) and 3(C) in H2O solution(containing 5% DMSO) incubation for 24 h at 298 K to detect the hydrolysis of the complexes and the absorbance intensity statistics of the complexes 1—3 for different incubation time(D)

闭环质粒DNA与药物结合后会改变其超螺旋密度, 从而改变其在凝胶电泳中的迁移速率[45]. 进一步通过凝胶电泳实验研究了配合物1～3与质粒pBR322 DNA的相互作用, 结果如图6所示. 随着配合物1和2浓度的增加, 超螺旋DNA带(Form Ⅰ)的迁移速率逐渐减小. 超螺旋DNA迁移速率的降低可归因于配合物解旋了DNA的超螺旋结构, 降低了其超螺旋度[46]. 配合物2与pBR322凝胶作用后[图6(B)], 开环DNA(Form Ⅱ)的量增多. 而配合物3与pBR322 DNA几乎不发生作用[图6(C)], 其浓度达到100 μmol/L时, DNA的超螺旋结构并未受到影响, 这说明芳基金属配合物与DNA的作用在很大程度上取决于中心金属原子的类型.

Fig.6 Gel electrophoresis assay of pBR322 DNA treated with different concentrations of complexes 1—3(A—C)

2.8 配合物的细胞摄取性能

在细胞毒性研究基础上, 进一步探索了配合物在白血病细胞NB-4中的分布情况. 摄取实验结果(图7)表明, 在孵育NB-4细胞24 h后3个配合物在细胞内均有大量摄取, 表明配合物具有较好的细胞膜通透性. 经配合物1处理后的NB-4细胞中钌元素在细胞核内的含量较高, 且细胞质和细胞核中钌含量比为0.71, 而配合物2和3则大部分富集在细胞质中, 线粒体和细胞核内的金属元素(Os和Ir) 含量均较低, 这是由于配合物1具有更高的亲脂性, 导致其在细胞核的富集量较高, 这也是配合物1活性高于配合物2和3的原因.

Fig.7 Intracellular concentrations of metal ions(Ru, Os and Ir) in different organelles after treated with complexes 1—3 using ICP-MS detection

综上, 配合物的抗肿瘤活性与其亲脂性、 细胞摄取量以及水解性密切相关[47～49], 亲脂性越好, 细胞摄取量越高, 药物的毒活性越高. 由上述结果可见, 配合物1的亲脂性高于配合物2和3, 从而导致Ru的细胞摄取量大于配合物2和3中铱和锇的摄取量. 同时, 配合物1的水解速率比配合物2和3快很多, 文献[50]报道芳基金属配合物可通过将离去基团氯除去后置换成水分子, 继续与蛋白或DNA相互作用才能发挥其抗肿瘤活性, 这就导致配合物1的细胞毒活性大于配合物2和3. 此结果为进一步设计高抗癌活性的芳基金属配合物提供了理论基础和实验依据.

3 结 论

以具有抗炎、 镇痛等功效的天然产物萘普生为导向分子, 利用双齿螯合结构的联吡啶桥联配体制备了Ru, Os及Ir 3个芳基金属配合物. 结果表明, 配合物1～3均可与DNA结合使其解旋, 并抑制COX-2的酶活性. 其中, 配合物1表现出比配合物2和3更好的水解性, 更容易在细胞核内富集, 从而使其对白血病细胞NB-4表现出更好的细胞毒活性. 本文结果对设计高效的芳基金属抗癌药物有一定的指导意义. 此外, 3个配合物的设计不仅保留了萘普生的抗炎活性, 也可用于调节芳基金属的生物活性, 丰富了芳基金属配合物的多功能化应用, 为新型金属药物的发展开辟了新思路.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20190534.