制藤茶水提物对大鼠急性咽炎作用及炎症因子的影响*

★ 郑海音 杨英祥 沙玫 张玉琴 褚克丹

（1.福建中医药大学中西医结合学院 福州 350122；2.福建海诚药业有限公司 福建 宁德352000；3.福建中医药大学药学院 福州 350122）

急性咽炎（acute pharyngitis）是一种常见的上呼吸道疾病，多由病毒、细菌感染或物理、化学因素刺激咽部粘膜引起。近些年来，由于作息时间紊乱和饮食不规律导致的急性咽炎发作也日益增多［1］。临床表现为咽喉部干痒，有灼热感或异物感。因多次复发或可演变成慢性咽炎，影响患者生活质量。

藤茶为葡萄科植物显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz.）W.T.Wang）的 新 鲜枝叶，主要生长于我国东南、江南山区［2］。具有清热解毒、利湿消肿的功效，民间常用于咽喉肿痛、感冒发热、小便黄赤、皮炎湿疹和高血压等疾病的防治［3］。福建中医药大学将藤茶炒制加工，研制为制藤茶（批准文号为闽2016ZP0001），其炮制方法已列入《福建省中药饮片炮制规范》。制藤茶性味，微甘、苦，微凉；归肺、肝经；对咽喉肿痛、失音有良好的治疗效果。本文探讨制藤茶水提物对急性咽炎模型大鼠状态和炎症因子的影响，为进一步利用制藤茶预防和治疗急性咽炎提供实验基础。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠60 只，雌雄各半，体重180～220g，购自浙江省实验动物中心（生产许可证号：SCXK（浙）2014-0001）。饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF 级动物饲养室（使用合格证：SYXK（闽）2014-005），室温（22±2）℃，湿度（60±5）%，喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食。

1.2 仪器与试药 喉头喷雾器（型号：WI66710，东 西 仪 科 技 有 限 公 司）；PCR 仪（Bio-rad）；Infinite M200 Pro 多功能酶标仪（TECAN）。

阿莫西林胶囊(山东淄博新达制药有限公司，规格：0.25g，批号：15050206)；氨水（国药集团化学试剂有限公司）；TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ 检测试剂盒（Biotechnology Systems）；RNeasy® Mini Kit（Qiagen）；RevertAid TM First stand cDNA Synthsis Kit（Thermo）；Power SYBR® Green PCR Master Mix（Thermo）。制藤茶（批号：170701，福建海诚药业有限公司），符合福建省中药炮制规范标准（FJ-ZP-2016-0001）。

2 方法

2.1 制藤茶水提物的制备 称取制藤茶约5kg，加入25 倍水浸泡30min，加热煎煮提取2 次，每次45min。取上层清液干净纱布过滤，合并滤液减压浓缩至生药浓度0.5g/mL 即得。

2.2 氨水急性咽炎大鼠模型的建立 SD 大鼠60只，雌雄各半，随机分为6 组，每组10 只，分别设为正常组，模型组，制藤茶低、中、高剂量组，阿莫西林阳性药组。参考相关文献及前期预实验结果，建立氨水急性咽炎模型［4-5］。除正常组以外，其余5 组使用喉头喷雾器给实验动物咽部喷20%浓度氨水，每次喷雾3 揿，每日上午、下午各1 次，连续3d 形成急性炎症，大鼠急性咽炎模型制备成功（大鼠表现为频繁搔抓口部、饮水、咳嗽、腹式呼吸等）。造模后第4 天，制藤茶水提物低、中、高剂量组分别灌胃给予大鼠4.375，8.75，17.5g/kg 剂量的药液，阳性对照组给予0.36g/kg 剂量的阿莫西林，给药体积为10mL/kg，正常组灌胃等体积的动物饲养用水，每天1 次，连续给药14d。末次给药1h 后，水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血后肉眼观察各组大鼠咽部情况。并按下述评判标准记录：频繁搔抓口部，饮水，并出现咽部充血、肿胀，黏膜呈鲜红色，积3 分；咽部肿胀，部分充血，积2 分；咽部肿胀，无充血，积1 分；无上述情况，积0 分。

2.3 炎症因子检测 ELISA 法检测血清样本TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10 及IFN-γ 含量，检测过程均按照试剂盒说明书进行操作。

2.4 Real time-PCR 检测制藤茶水提物对急性咽炎模型大鼠炎症相关基因的影响 水合氯醛麻醉大鼠，摘取咽部粘膜及组织，液氮中保存。常规方法提取总RNA，检测RNA 浓度和纯度，选用20μL 反应体系，逆转录成cDNA。进行Real time-PCR 扩增，引物碱基序列见表1。最后以GAPDH 为内参，计算F 值（F=2-ΔΔCt），进行结果分析。F 值即为各实验组与空白组mRNA 表达的相对差异。

表1 引物碱基序列

2.5 统计分析 采用SPSS 20.0 统计软件对实验数据进行统计分析，结果均用（）表示，不同组间采用方差分析，当P＜0.05 时，具有显著性差异，当P＜0.01 时，具有极显著性差异。

3 结果

3.1 一般状态的影响 造模后大鼠呈现摄食减少，饮水频繁，口腔粘性分泌物增多，咽部粘膜充血肿胀，毛色发暗，活动减少等状态。给药结束时，阳性药组和制藤茶中、高剂量给药组大鼠摄食和饮水量较正常组相似，口腔粘膜充血肿胀状态得到改善，活动基本正常。同时期模型组状态无明显改善。各组大鼠咽部病变积分情况见表2，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。

表2 制藤茶水提物对急性咽炎模型大鼠的影响（，n=10）分

表2 制藤茶水提物对急性咽炎模型大鼠的影响（，n=10）分

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

组别 积分均值正常组 0.00±0.00模型组 2.80±0.42##制藤茶低剂量组 1.80±0.60**制藤茶中剂量组 1.40±0.58**制藤茶高剂量组 1.30±0.56**阳性药组 1.30±0.54**

3.2 对炎症因子含量的影响 ELISA 法检测血清样 本TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10 和IFN-γ 指标结果见表3。与正常组相比，模型组大鼠血清TNFα、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 含量显著升高（P ＜0.05，P＜0.01），IL-10 含量显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，制藤茶中、高剂量给药组TNFα、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 指标含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-10 含量显著升高（P＜0.05）。

表3 制藤茶水提物对急性咽炎模型大鼠血清炎症因子的影响（，n=10） pg/mL

表3 制藤茶水提物对急性咽炎模型大鼠血清炎症因子的影响（，n=10） pg/mL

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 TNF-α IL-1β IL-6 IL-10 IFN-γ正常组 562.55±29.67 3.36±0.12 78.36±4.63 89.86±1.45 356.85±19.98模型组 957.51±44.21## 12.21±0.44## 296.68±11.22## 33.57±4.28## 921.68±95.79##低剂量组 845.36±28.60* 12.07±0.81 292.35±28.64 41.65±6.89 797.21±48.92**中剂量组 632.51±27.58** 9.51±0.33* 171.53±14.33** 69.59±2.37* 672.55±34.87**高剂量组 416.28±21.56** 7.25±0.21** 145.28±7.82** 77.24±3.45** 307.68±42.68**阳性药组 412.17±18.54** 4.82±0.37** 138.26±6.71** 62.88±1.36** 389.85±45.29**

3.3 对炎症因子相关基因表达的影响 与正常组相比，模型组大鼠组织中TNFα、IL-1β 及IL-6炎症相关基因表达显著上调（P＜0.05，P＜0.01），IL-10 基因表达显著下调（P＜0.01）。与模型组相比，制藤茶中、高剂量给药组TNFα、IL-1β、IL-6 基因表达显著下调（P＜0.05，P＜0.01），IL-10 基因表达显著上调（P＜0.05），见表4。

表4 制藤茶水提物对急性咽炎模型大鼠咽部组织炎症因子基因表达的影响（，n=10）

表4 制藤茶水提物对急性咽炎模型大鼠咽部组织炎症因子基因表达的影响（，n=10）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 TNF-α IL-1β IL-6 IL-10正常组 1.05±0.07 1.03±0.37 1.02±0.12 1.05±0.07模型组 2.31±0.19## 1.81±0.47## 4.21±1.03## 0.71±0.06##低剂量组 2.26±0.16 1.87±0.71 3.68±1.54 0.69±0.09中剂量组 1.98±0.15* 1.54±0.43* 2.64±1.25* 0.74±0.15高剂量组 1.58±0.09** 1.49±0.52* 1.95±0.88** 0.92±0.05*阳性药组 1.47±0.14** 1.43±0.41* 1.39±0.61** 0.97±0.04**

4 讨论

藤茶提取物具有抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤和降血脂活性。藤茶富含多糖类、黄酮类成分，如二氢杨梅素、杨梅素、花旗松素等，其中二氢杨梅素的含量可高达约38%［6］。有研究报道二氢杨梅素具有降糖、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保肝和神经保护作用［7］，药理机制研究表明可以通过抑制NF-κB 的活化，抑制p38 和JNK 磷酸化来发挥其局部抗炎作用［8］。

本实验选取的检测指标，TNF-α（血清肿瘤坏死因子）、IL-1β（白细胞介素1β）、IL-6（白细胞介素6）、IL-10（白细胞介素10）是炎症反应中起主要作用的细胞因子。TNF-α 主要由活化的巨噬细胞、NK 细胞及T 淋巴细胞产生。IL-1β、IL-6 主要是由T、B 淋巴细胞和单核巨噬细胞分泌的细胞因子，能够显示炎症发生时的损伤程度。IL-1β 与TNF-α 的释放相互促进，并可引起体温升高等严重反应［9］。IL-10 能够抑制活化的T 细胞产生细胞因子，也曾称为细胞因子合成的抑制因子。IFN-γ（γ 干扰素）主要由活化的T、B 淋巴细胞分泌，也可由NK 细胞和巨噬细胞产生，并能促使巨噬细胞活化，具有多种生物活性和种属特异性。

本研究从细胞因子和基因角度考察了制藤茶水提物治疗急性咽炎的效果。结果显示制藤茶水提物对氨水急性咽炎大鼠的咽部症状有明显改善作用，能够显著降低造模大鼠血清中TNFα、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 含量，显著下调炎症相关基因表达；显著增加造模大鼠血清中IL-10 含量，显著上调IL-10 基因表达。呈现与阿莫西林一致的效果，表明制藤茶水提物对急性咽炎具治疗效果。为下一步开发利用制藤茶，发挥其治疗急性咽炎的药效，提供了动物实验支持。制藤茶作为一种“药食同源”的药物，安全性应当优于常规药物，其药效物质基础同样值得进一步研究。