健脾养血汤对特异性皮炎小鼠模型中Toll 样受体的表达影响及意义

★ 白书仙 卫静 贺琪 龙剑文 石全 李恒

（湖北省中医院皮肤科 武汉 430061）

特异性皮炎（atopic dermatitis，AD），又称遗传过敏性皮炎，是常见的一种慢性的非特异性皮肤炎症。目前发病机制尚不明确，目前认为免疫炎性反应在发病过程中发挥了重要作用［1］。

Toll 样 受 体（toll-like receptors，TLRs） 介导的免疫反应在机体免疫应答过程中发挥重要作用［2］。目前，TLRs 与AD 发病的联系成为研究热点。有研究表明，TLRs 参与AD 免疫反应和炎症反应过程，与疾病的严重程度相关。在本文中，我们通过BABL/c 小鼠建立AD 的动物模型，观察健脾养血汤对特异性皮炎小鼠模型中Toll 样受体的表达影响情况。

1 实验材料与方法

1.1 主要试剂 Total RNA 提取试剂（RNAiso Plus）购 买 于 日 本TAKARA 公 司，5×PrimeScript®RT Master Mix 逆转录试剂盒购买于TAKARA 公司，SYBR®Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）购买于TAKARA 公司。2，4- 二硝基氟苯（DNFB）购于美国sigma 公司。

1.2 动物模型制备 BABL/c 雌性小鼠进入实验室后，标准饲料饲养1 周后进入实验。参照Heller 等［3］的方法制备AD 小鼠模型。实验前1d，以剃刀剃除小鼠背部面积约2cm×3cm 毛发，剃毛处外涂100mL0.5%DNFB 进行诱导,连续10d。造模成功后，模型组小鼠背部皮肤表现为红斑、丘疹、增厚、结痂，皮肤干燥，可见干裂。

1.3 实验药物制备 健脾养血汤水煎液配方为：党参15g，茯苓20g,白术15g，黄芪30g，白鲜皮20g,地肤子20g，土茯苓30g，当归20g，制首乌10g，荆芥10g,防风10g,乌梅15g,五味子15g，甘草10g。

1.4 实验分组 BABL/c 雌性小鼠（武汉大学实验动物中心提供）30 只，体重15～20g。按照随机数字表将实验动物分为正常对照组、特异性皮炎模型组、中药治疗组，每组10 只。健脾养血汤治疗组予健脾养血汤水煎液灌胃（10mL/kg），正常对照组和特异性皮炎模型组予等量生理盐水灌胃，连续1 周。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）测定各组TLR2、TLR3、TLR4、TLR9 表达 RNA制备试剂盒提取皮肤组织总RNA，采用TAKARA逆转录及实时荧光定量试剂盒检测Toll 样受体mRNA 的表达，以三磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）作为内参对照。反应参数：95℃变性4min；95℃ 30s，55℃1min，72℃1min，35 个循环；72℃延伸5min。每个样本设置3 个复孔，使用StepOne Software v2.1 软件（Applied Biosystems 公司）分析PCR 过程各检测样本的Ct（Threshold cycle）值，CT 值代表荧光实时定量PCR 的结果，ΔCT=CT（目的基因）-CT（内参基因），ΔΔCT=ΔCT（实验组）-ΔCT（对照组）。根据公式可以算出各组细胞中目的基因表达/对照组细胞中目的基因表达=2-ΔΔCT 表 示［4］。采用primer premier 5.0 软件设计引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。具体序列如下：TLR2（上游引物：5'- GCTCCTGCGAACTCCTATCC-3'，下 游 引 物：5'- CAGCAGACTCCAGACACCAG-3'）；TLR3（上游引物：5'- GGCAGCAGGTGGAATTTGTAT-3'，下游引物：5'- CCAAGTTGCCGTTTCTTGTT -3'）；TLR4（上游引物：5'- GCTCACGCGCAGACACATCC-3'，下游引物：5'- CAGCACACTTCAAGACCCAG-3'）；TLR9（上游引物：5'- GGCGCAGGATGGAATTTGTAT-3'，下游引 物：5'- CCAAGTACGTACGTTCTTGTT -3'）；GAPDH（上游引物：5'- CAGCAAGGACACTGAGCAAGA-3'，下游引物：5'- GCCCCTCCTGTTATTATGGGG -3'）。

1.6 皮肤炎症分数检测 评估治疗后1 周皮肤炎症的分数，按照研究者整体评价法评估皮损处水肿、红斑和出血的严重程度进行评分［5］。采用六级评分法评为0～5 分：0 分为无皮损；1 分为几乎没有皮损仅有可察觉的红斑和丘疹/浸润；2 分为轻度的红斑和丘疹/漫润；3 分为中度的红斑和丘疹/浸润；4 分为重度的红斑和丘疹/浸润；5 分为非常严重伴有渗出和结痂的严重的红斑和丘疹/浸润。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件进行统计学处理，数据以（）表示，采用两样本的t检验法进行检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光定量PCR 法检测各组TLR2、TLR3、TLR4、TLR9 表达 图1 显示，模型组小鼠皮肤组 织 中TLR2，TLR3、TLR4、TLR9mRNA 表 达明显升高，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗组皮肤组织TLR2，TLR3、TLR4、TLR9mRNA 表达较模型组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 实时荧光定量聚合酶链反应测定TLR2、TLR3、TLR4、TLR9mRNA表达

2.2 健脾养血汤剂对皮肤炎症分数的影响 评估治疗后1 周皮肤炎症的分数，模型组分数较正常组显著增高（P＜0.05），健脾养血汤剂治疗组皮肤炎症分数低于模型组（P＜0.05）。见表1。

表1 健脾养血汤治疗特异性皮炎小鼠模型后皮肤炎症评分（n=10）

3 讨论

特应性皮炎是一种与遗传及免疫相关的复发性炎性皮肤病，以剧烈瘙痒、皮肤屏障异常、以及多种致病微生物如金葡萄球菌、真菌及某些病毒的定植与感染为特征，发病机制尚不明确。有研究表明AD 患者的发病与Toll 样受体密切相关。TLRs目前在感染性皮肤病如带状疱疹、麻风病、念珠菌病、皮肤利什曼病及一些皮肤免疫相关疾病中成为研究热点［6］。本研究也发现在特异性模型组中TLR2、TLR3、TLR4 及TLR9mRNA 水平较正常对照组明显增加，说明TLR2、TLR3、TLR4 和TLR9可能参与了特异性皮炎发病过程中的免疫反应。

TLRs 是一种模式识别受体，它可以通过识别、结合外界病原体的病原相关分子模式和机体组织损伤相关分子模式，激活下游信号通路，启动依赖性髓样细胞分化因子88（myeloid differentiation factor,MyD88）和非依赖性MyD88 的β 干扰素TIR 结构域衔接蛋白（toll/IL-1receptor domain containing adaptor inducing IFN-β，TRIF）信号转导途径，诱导NF-κB 核转录，刺激促炎细胞因子的产生［2］。因此，采取干预TLRs 信号通路进而抑制下游产生的过多的炎性因子可能成为一种治疗特异性皮炎的策略。我们通过健脾养血汤治疗特异性皮炎小鼠发现TLR2、TLR3、TLR4 及TLR9mRNA水平较模型组均明显下降，皮炎炎症分数也相应降低，说明健脾养血汤可以抑制TLR2、TLR3、TLR4及TLR9mRNA 表达进而产生抗炎作用。

西医治疗特异性皮炎多使用含有糖皮质激素的软膏治疗效果较好，但长期使用会带来如皮肤变薄、毛细血管扩张、多毛、病情反复发作等许多不良反应［7］。中药一直广泛用于治疗皮肤疾病，而且临床研究结果表明中药是有效、安全的治疗方法之一。我们的研究结果提供了健脾养血汤通过抑制Toll 样受体治疗特异性皮炎的理论依据。总之，我们在动物体内证实健脾养血汤抑制Toll 样受体的作用，但其抑制作用还需在特异性皮炎患者体内得到进一步证实。