贮存温度对巴氏杀菌乳中游离氨基酸组成及品质的影响

李蕊，王一然，刘丽云，耿丽娟，史海粟，岳喜庆，武俊瑞

（1.沈阳农业大学食品学院，沈阳110866；2.沈阳蒙牛乳业沈阳110121；3.沈阳食品检验所沈阳110136）

0引言

巴氏杀菌乳因保留了鲜乳中主要的营养物质和滋味，深受消费者青睐，但由于杀菌温度较低，在巴氏杀菌乳的贮存过程中，残留在乳中的部分耐热菌和耐热酶的活动会影响其蛋白质游离氨基酸组成及含量，进而对巴氏杀菌乳的滋味、营养产生一定的变化[1-2]，导致巴氏杀菌乳目前在我国仍不能进行远距离流通和销售，大大制约了巴氏杀菌乳的发展及食用。

另一方面，乳中的游离氨基酸不仅会影响乳的营养品质，滋味，同时也是必需氨基酸摄入的一种主要方式，近几年来，关于氨基酸对人体的影响也有了新的认识[3]。原料乳中游离氨基酸含量及组成不仅受到乳品种、热处理等的影响[4-5]，在其贮存期间游离氨基酸也是动态变化的，掌握其变化的规律以及变化特征可以为工业上乳品的质量控制以及远距离销售提供指导。UHT乳在贮存过程中赖氨酸和异亮氨酸含量增加，并且游离氨基酸的变化导致了牛乳的腐败气味和变黄[6]。然而，对于巴氏杀菌乳贮存过程中游离氨基酸的变化却没有详尽且全面的研究。

本研究主要通过对不同贮存温度和时间的巴氏杀菌乳中游离氨基酸的种类、含量和组成进行测定，并通过主成分分析、游离氨基酸与巴氏杀菌乳电子舌味感的相关性分析，试图揭示贮存温度对巴氏杀菌乳中游离氨基酸组成及滋味的影响，以期为我国巴氏杀菌乳加工和销售企业，以及广大消费者食用巴氏杀菌乳提供指导。

1材料与方法

1.1试验材料

大型乳品企业当天生产销售的巴氏杀菌商品乳，分别置于0、4、10、15、25和37℃下贮藏0-15天。

1.2仪器与设备

L-8900型全自动氨基酸分析仪日本日立公司；YCD-EL259医用冷藏冷冻箱中科美菱低温科技股份有限公司；120乳品综合成分指标分析仪美国FLOWSERVE公司。

1.3乳中游离氨基酸含量的测定

1.3.1样品前处理

分别取不同条件下的巴氏杀菌乳样品进行离心，并加入5%磺基水杨酸溶液，离心取上清，用0.22μm微孔滤膜过滤备用。

1.3.2氨基酸分析的色谱条件

分析柱（4.6 mm×60 mm）柱温为57.0℃，反应柱温度为135℃，泵1流速为0.45 mL/min，泵2流速为0.35 mL/min，进样量20μL。紫外检测器：脯氨酸在波长440 nm处测定吸光度，其他氨基酸在波长570 nm处测定吸光度。

1.3.3氨基酸营养评价

利用氨基酸比值法，根据FAO/WHO推荐的模式谱为参考，根据待测蛋白质中必需氨基酸(EAA)的含量，分别计算氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系数(RC)。来进行对氨基酸的营养分析。公式如下所示：

1.4巴氏杀菌乳蛋白质含量、酸度与电子舌味感的测定

利用120乳品综合成分指标分析仪对巴氏杀菌乳中蛋白质含量进行快速测定；巴氏杀菌乳酸度的测定是根据GB5413.34-2010中乳和乳制品酸度中的测定方法。

1.5数据分析与处理

采用Excel、SPSS20.0对数据进行统计分析，用python进行主成分分析、相关性分析以及热图的制作。

2结果与分析

2.1贮藏温度和时间对巴氏杀菌乳蛋白质含量的影响

图1不同温度和贮存时间下巴氏杀菌乳蛋白质含量的变化

由图1可看出，巴士杀菌乳中的蛋白质含量整体呈下降趋势，且前三天快速下降，在3-12 d内，4、25℃变化较缓慢，且4℃条件下在12 d时蛋白质含量最高，25℃条件下在12 d时蛋白质含量最低。其他温度处理组在3～9 d内变化不大，9 d后快速下降。整体来看，在0～9 d内0℃条件下巴氏杀菌乳中的蛋白质含量在贮存过程中相对稳定，且品质较好，在贮藏期内，4℃条件下的蛋白质含量相对稳定，均保持在标准含量2.9 g/100g以上。这与李冬梅等[7]人研究结果相似。可以看出，9 d后，0℃条件下巴氏杀菌乳中的蛋白质含量快速下降，分析这种现象是由于乳中的微生物大量分解蛋白导致的，其变化过程有待进一步研究。在25℃条件下贮存的巴氏杀菌乳蛋白质含量下降最快，且均降低于0、4、10℃条件下相应的蛋白质含量。由此可看出贮存温度对巴氏杀菌乳中蛋白质含量有较大影响。同时，贮藏天数及贮藏温度的增高，也会导致乳中微生物的滋生[8]或乳中存在的酶将蛋白质分解，从而影响其蛋白质含量的变化。Fitouhi Nahla[9]等人均在超巴氏杀菌乳和UHT乳不同贮存期间检测到了高活性的蛋白酶。综合以上结果显示，虽然巴氏杀菌乳在货架期内，但其营养品质还是受到温度的影响而产生变化，也同时强调了低温贮藏的重要性。

2.2贮存温度和时间对巴氏杀菌乳酸度的影响

图2不同贮存温度时间巴氏杀菌乳酸度的变化

酸度是反应巴氏杀菌乳品质的一个重要指标，由图2可知，在0℃，0 d时，巴氏杀菌乳的起始酸度为16°T，稍高于倪晓宇的研究结果[10]，即巴氏杀菌乳的起始酸度为14°T。不同温度下贮存的巴氏杀菌乳的酸度随着时间的推移逐渐升高。温度越高，其酸度升高趋势越快。在贮存到第三天时，巴氏杀菌乳酸度突变。在15、25℃下贮藏的牛奶在0-3天内的酸度都以超过了18°T，表明其品质已经变坏不能食用。0、4℃下贮藏的巴氏牛奶在9天以内、10℃下贮藏的巴氏杀菌乳在6天以内的酸度稳定在18°T以下。

2.3贮存过程巴氏杀菌乳游离氨基酸的变化

2.3.1贮存条件对巴氏杀菌乳总游离氨基酸含量的影响

图3不同贮存温度和时间巴氏杀菌乳中总游离氨基酸变化

由图3可以看出，在0℃贮藏条件下，巴氏杀菌乳中的总游离氨基酸含量没有显著的变化（p＞0.05），维持在10 mg/mL左右，而在其他温度下贮藏的巴氏杀菌乳总游离氨基酸含量则有显著变化，随着温度的升高，变化越显著。当贮存到第三天时，乳中总游离氨基酸含量突变，不同温度下贮存的巴氏杀菌乳中总游离氨基酸含量均不同程度下降，而随着贮存时间的推移，巴氏杀菌乳中总游离氨基酸的含量又出现了明显的上升趋势（p＜0.01）。且贮存温度越高，乳样品中总游离氨基酸含量上升速度越快。其结果与郭奇慧等[11]在UHT乳中游离氨基酸的变化趋势一致，表明乳品的类型对游离氨基酸含量变化趋势影响不大。在贮存过程中乳游离氨基酸可以通过酶的作用而裂解；同时乳样品中的嗜冷菌仍然存在，也会利用乳中的氨基酸[8]；另一方面，乳贮存过程中氨基与还原糖发生美拉德反应，且温度越高，变化越显著，这与Anne Vuholm Sunds等[12]人的研究结果相一致。这些可能是总游离氨基酸含量会下降的原因。但随着贮存时间增长，乳中还会发生其他化学反应，导致在不同温度条件下，总游离氨基酸又发生不同程度的升高。如图1，蛋白质的分解以及微生物的活动，还会产生游离氨基酸，使总游离氨基酸含量最后呈现上升的趋势。

2.3.2巴氏杀菌乳游离氨基酸种类及其含量变化

如图4，巴氏杀菌乳中的谷氨酸（Glu）含量最多，为5.6 mg/100mL，其次是酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys），而苏氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、组氨酸（His）、异亮氨酸（Ile）含量较少。0℃12 d内贮存的巴氏杀菌乳中游离氨基酸含量相对稳定，变化不显著（p＞0.05），其游离氨基酸组成也不变。4℃条件贮存的巴氏杀菌乳中，蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys）的含量在12 d内保持稳定，变化不显著（p＞0.05）；赖氨酸（Lys）的含量随着时间的推移而增加；其他游离氨基酸含量在贮存过程中逐渐减少，天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）和丙氨酸（Ala）含量均在4℃贮存3 d后急剧下降，此时假单胞菌属（Psedomonas）、气单孢菌属（Aeromonas）的含量显著上升[13]，微生物可以利用脱羧酶使氨基酸分解产生组胺、酪胺等，引起氨基酸含量的突然下降[14]，4℃贮存3 d后的巴氏杀菌乳即使在感官评价上并没有变质，但是其游离氨基酸组成发生了极大变化，巴氏杀菌乳的营养品质大大降低，不能保证人体对游离氨基酸的摄取。在10、15、25℃贮存条件下，巴氏杀菌乳中天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、缬氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）变化相似，均呈现先减少后增加的趋势；甘氨酸（Gly）和精氨酸（Arg）含量逐渐减少；赖氨酸（Lys）和蛋氨酸（Met）含量随着贮存时间的推移而增加，贮存3d后，巴氏杀菌乳的游离氨基酸组成发生明显变化，仅检测到赖氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、苏氨酸（Thr）、胱氨酸（Cys），虽然在10℃贮存9 d后、15℃贮存6 d后以及25℃贮存3 d后可以发现天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）含量发生显著上升，但从酸度的结果可以看出此时的巴氏杀菌乳已经变质不能食用。

图4不同贮存温度、时间下巴氏杀菌乳中游离氨基酸动态变化

谷氨酸（Glu）[15]具有化解氨毒、参与脑中蛋白和糖的代谢，促进氧化，改善中枢神经活动；甘氨酸（Gly）[16]可以降低血液中胆固醇、血糖的浓度，并具有甜味，在贮藏3 d时甜味骤然下降，可推测甘氨酸（Gly）也是影响巴氏杀菌乳味感的因素之一。同时，贮存过程中牛乳产生的苦味也与蛋白质水解产生的游离氨基酸水平有关。C端疏水性氨基酸残基、N端亲水性氨基酸以及总疏水性与苦味有很高的相关性[17]。即赖氨酸、精氨酸等游离氨基酸在较高温度条件下贮存期间含量的增加可能是巴氏杀菌乳产生苦味的因素之一。近年研究表明，摄入精氨酸以及益生菌后，结肠内腔中的腐胺丰度明显增加，鉴定一条新的腐胺生成通路，进一步认识了精氨酸在肠道中的作用[18]。精氨酸在巴氏杀菌乳贮存过程中含量的减少也将影响着这一作用。酪氨酸（Tyr）是造肾上腺素、甲状腺素和黑色素的必需氨基酸，也是神经传递物质和激素的前驱物，可以进行体内氨基酸转化反应，是乳中含量多且起到重要角色的氨基酸，其含量影响着巴氏杀菌乳的营养品质。酪氨酸（Tyr）与其他氨基酸在贮存过程中都发生了复杂的含量变化，可以说明的是，这与复杂的蛋白组学及乳中微生物的动态变化密切相关，值得我们进一步去探索研究。

2.3.3不同贮存条件对巴氏杀菌乳中游离氨基酸RAA、RC值的影响

利用氨基酸比值系数法（RC）对没有变质的巴氏杀菌乳中游离氨基酸进行营养学评价[19]。结果如表1所示。在0℃下贮藏的巴氏杀菌乳中未检测到游离苏氨酸（Thr）的存在，但缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）+胱氨酸（Cys）的量都达到了WHO/FAO要求的氨基酸模式推荐要求，且在贮存期间也保持稳定。在4℃条件下贮存的巴氏杀菌乳在3天内其RAA、RC值保持稳定，而6天后，Val、Ile、Leu的RAA、RC值减少为零。在10℃下贮藏的巴氏杀菌乳中，0 d、3 d都未检测出来游离的苏氨酸（Thr），从贮藏3 d开始就未检测出缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）。苯丙氨酸（Phe）+酪氨酸（Tyr）的含量只有在贮藏0 d～3 d内接近WHO/FAO要求的氨基酸模式推荐要求。苏氨酸（Thr）的生理功能就是转变某些氨基酸达到平衡，缺乏时会使人消瘦[20]；缬氨酸（Val）功能主要就是促进神经系统功能的正常运作；而蛋氨酸（Met）参与胆碱的合成，具有去脂的功能；苯丙氨酸（Phe）的生理功能就是可在体内转变为酪氨酸（Tyr），促进甲状腺素和肾上腺素的合成。以上结果表明，任何温度贮藏一定时间后，都会对巴氏杀菌乳中的游离氨基酸产生影响，尽管在货架期内未发生腐败变质，不影响食用，但在氨基酸角度分析，其游离氨基酸含量发生了较大改变，营养品质已经大大降低，不能保证营养的零损失。为最大化的保证其营养品质，应尽快食用。

表1巴氏杀菌乳RAA、RC值

2.3.4巴氏杀菌乳的主成分分析

图5巴氏杀菌乳中游离氨基酸含量的主成分分析

从图中可以看出，正常的巴氏杀菌乳与变质的巴氏杀菌乳在游离氨基酸含量角度来看距离较远，具有明显的区分，说明变质的巴氏杀菌乳与正常的巴氏杀菌乳的游离氨基酸含量存在很大的差异，其中第一变量PC1为67.77%，第二变量PC2为26.51%。同时，组间分离较为清楚，组内聚集性较好。且从图中可以看出，正常的巴氏杀菌乳的各个样品点之间距离较近，说明每个样品重复性好，游离氨基酸含量较为稳定，进一步说明其营养价值较为稳定。而变质的巴氏杀菌乳，虽然聚集程度相对明显，但各个样品点之间距离有所不同，说明变质的巴氏杀菌乳中游离氨基酸含量不稳定，进一步验证了变质的巴氏杀菌乳营养价值低的观点。综合以上结果，可以看出巴氏杀菌乳货架期或品质也许可以通过测定几种游离氨基酸的含量来表述。而如何从氨基酸角度进行具体的营养分析还需要进一步研究。

2.3.5巴氏杀菌乳中游离氨基酸与滋味相关性分析

表2为贮存过程中巴氏杀菌乳各游离氨基酸与酸、甜、苦、辣、鲜五种味感值的相关性分析。由图可知，酸味和涩味与大部分游离氨基酸含量呈正相关，苦味和甜味则与大部分氨基酸呈负相关，其中Lys含量与酸味、苦味和涩味呈显著正相关，与甜味和鲜味呈显著负相关，Arg的含量与苦味呈正相关，该结果与之前所说Lys、Arg可能是巴氏杀菌乳变苦的原因相符。同时，Asp、Val和Thr的含量与甜味呈较高的负相关性，Gly的含量与鲜味呈较高的正相关性。

3结论

0℃9 d内贮存的巴氏杀菌乳中游离氨基酸含量相对

稳定，其游离氨基酸组成也不变。4℃条件贮存的巴氏杀菌乳中，Met、Cys的含量在12 d内保持稳定；Lys的含量随着时间的推移而增加；其他游离氨基酸含量在贮存过程中逐渐减少，Asp、Glu、Tyr、Arg和Ala含量均在4℃贮存3 d后急剧下降，此时巴氏杀菌乳的营养品质大大降低，不能保证人体对游离氨基酸的摄取。在10、15、25℃贮存条件下，贮存3 d后，巴氏杀菌乳的游离氨基酸组成发生明显变化，仅检测到Lys、Met、Phe、Thr、Cys。推荐巴氏杀菌乳贮存条件为0℃12 d内、4℃3 d内，不建议10℃、15℃、25℃下贮存。0℃贮存条件下可以延长巴氏杀菌乳的货架期，可以实现巴氏杀菌乳的远距离运输与销售。巴氏杀菌乳中各游离氨基酸含量与滋味相关性结果表明，Lys与5种味感均呈现显著相关性，表明Lys是影响巴氏杀菌乳滋味的特征氨基酸。

表2巴氏杀菌乳中游离氨基酸与滋味相关性Table 2 Correlation between free amino acidsand flavor in pasteurized milk