奶粉中N-乙酰神经氨酸的检测

李金慧，赵非，刘璇，卢昊，李克峰，王旭，

（1.天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津300457；2.天津桑尼匹克生物科技有限公司，天津300457）

0引言

唾液酸(Sialic acids,SA)作为一类天然糖类，最初是由Blix[1]将牛下颌唾液腺蛋白分离得到的，被人们广泛的应用于生物系统中，所以才被命名为唾液酸。大部分哺乳动物组织中发现的唾液酸主要是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac），其在乳中所占质量比例可达到96%左右，因此通常把Neu5Ac称为唾液酸[2]。

2017年12月19日，唾液酸被欧盟规定为是一种新食品原料而且广泛存在于自然界中。唾液酸的食物来源主要是母乳，母乳中的它的最主要存在形式是唾液酸低聚糖，也就是与低聚糖结合的形式[3]。母乳中唾液酸的含量为0.3～1.5 g/L，尤其在初乳中含量可以达到1 g/L[4-5]。唾液酸也存在于牛奶、奶粉和鸡蛋中等[6]。研究发现，唾液酸是一种天然的大脑营养素，唾液酸可通过提高大脑神经细胞的信息传递速度促进婴儿的记忆力和智力发育，还可以提高儿童肠道吸收能力及儿童免疫力[7]，所以部分婴幼儿配方乳粉的生产厂家以此为商品的宣传点，将其产品的唾液酸含量标示于包装之上，一般产品中唾液酸的含量在100～200 mg/100g之间[8]。

为了规范以及促进婴幼儿奶粉产品的发展，需要对唾液酸标识值进行有效的核实，因此需要一种合适的方法对于唾液酸含量进行定性以及定量分析。目前，对于唾液酸的定性定量分析的方法主要是比色法[9]、高效液相色谱法[10]、液相色谱-质谱法[11-12]、薄层分析法[13]等，而最常用的方法则是高效液相色谱法。本研究采用HPLC-FLD法，可以准确测定奶粉中唾液酸含量，该方法具有简单快速，检测准确，灵敏度相对较高等特点。

1实验

1.1仪器设备

Agilent-1260型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；TGL-16G型高速离心机，上海安亭科学仪器厂；ABL半微量电子天平，艾德姆衡器有限公司；PL-S30T型数显超声波清洗机，上海博科科学仪器有限公司；涡旋混匀振荡器，Thermo Scientific。

1.2材料试剂

市售婴儿配方奶粉；实验用水为Milli-Q纯水仪制备的超纯水；邻苯二氨盐酸盐(OPD)美国Sigma公司；N-乙酰神经氨酸标品安谱实验科技股份公司；乙腈（色谱纯）Fisher Chemical公司；甲酸、乙酸（色谱纯）赛默飞世尔科技公司；NaHSO 3（分析纯）阿达玛斯试剂公司。

1.3方法

1.3.1色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱温为30℃；流速：1 mL/min；进样体积：10μL；采集时间：17 min；检测器为荧光检测器，激发波长：337 nm，发射波长：448 nm;流动相A为超纯水；流动相B为乙腈；流动相洗脱程序(如表1所示)。

表1流动相的洗脱程序

1.3.2溶液配制

1.3.2.1衍生化试剂的制备

首先准确称量0.209 g NaHSO 3于10mL的容量瓶中，加蒸馏水定容到10 mL，配制成0.2 mol/L的NaHSO 3溶液。然后称取0.1 g OPD试剂，并在避光下加入10 mL配置好的0.2 mol/L的NaHSO 3溶液中，震荡直到全部溶解，即配制成了10 mg/mL的邻苯二胺盐酸盐溶液。

1.3.2.2标准溶液的配制

称取N-乙酰神经氨酸标准品配制成2 mg/mL的标准品储备溶液。之后分别配制成0.5，1，10，50，200μg/mL的溶液，并取出1 mL加入200μL的衍生化试剂，并于80℃水浴100 min，然后冷却到室温，再用0.22μm滤膜过滤，取滤液，得到所需的N-乙酰神经氨酸标准品溶液。

1.3.3样品前处理

精准称取奶粉1 g，置于50 mL离心管中，再加入10 mL的温水（50～60℃)溶解。涡旋后取出600μL置于1.5 mL离心管中，并加入600μL 0.1 mol/L的甲酸溶液进行酸水解，充分振荡摇匀，置于80℃下水浴180 min，然后冷却到室温，在13 000 r/min的条件下离心10 min。取1 mL上清液于新的1.5 mL离心管中，加入200μL浓度为10 mg/mL邻苯二胺溶液，摇匀后置于80℃水浴下衍生100 min，冷却，再将其在13 000 r/min的条件下离心10 min，取1 mL上清液并用0.22μm一次性针头式滤头过滤，装瓶待测。

1.3.4专属性

取1 mL 200μg/mLN-乙酰神经氨酸标准品溶液和1 mL衍生化试剂OPD的水溶液，按上述的色谱条件进样测定。

1.3.5线性关系与检测限

稀释N-乙酰神经氨酸标准品储备液,得到质量浓度分别为0.5，1，10，50，200μg/mL的系列标准品溶液，按上述色谱条件分别进样测定，横坐标选取标准品质量浓度(X)，纵坐标选取峰面积(Y)，并绘制线性回归曲线。然后根据信噪比S/N=3测出最低检出限。

1.3.6精密度

取1 mL 100μg/mL的标准品溶液，平行制备6份样品溶液，在上述色谱条件下分析，记录色谱图，选取目标色谱峰，测定保留时间及其峰面积，计算相对标准偏差(RSD)。

1.3.7重复性

取1 mL 100μg/mL的标准品溶液，按上述色谱条件连续测试6次，记录色谱图，选取目标色谱峰，测得峰面积值，并计算相对标准偏差。

1.3.8稳定性

取1 mL 100μg/mL的标准品溶液，于4℃条件下分别放置0，1，2，4，6，8，10 h后，按上述色谱条件分别进样分析，测得峰面积值，并计算相对标准偏差。

1.3.9加样回收率

取已知含量的同一供试品3份，每份中分别加入高、中、低三个体积浓度的N-乙酰神经氨酸标准品溶液（10，50，200μg/g），平行测定3次，按上述色谱条件下进行测定，计算待测组分N-乙酰神经氨酸的加样回收率。

1.3.10样品检测

按照1.3.3的前处理方法和1.3.1的色谱条件方法，测定市售的6种奶粉中唾液酸的含量。

2结果与讨论

2.1高效液相色谱条件的优化

文献报道的高效液相色谱方法流动相为甲醇-乙腈-超纯水7∶8∶85，等度洗脱。但是这种方法检测耗时较长（Neu5Gc和Neu5Ac出峰时间分别为12 min和16 min左右），同时三相流动相较为复杂，所以对液相方法的流动相进行优化。

流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，之后尝试将流动相水和乙腈变换成甲醇和水，结果表明两种物质的出峰时间均延迟，Neu5Gc的出峰时间从4.5 min延迟到9.5 min，Neu5Ac的出峰时间从4.8 min延迟到10.0 min。所以选择水-乙腈流动相。如图1为最终优化的液相条件下200mg/L的混合标准品的色谱图。

图1 200 mg/L的混合标准品色谱图

2.2衍生化条件的优化

2.2.1衍生化温度的优化

取1 mL100μg/mL的标准品溶液加入200μL OPD衍生溶液，分别置于40，50，60，70，80℃下，450 r/min混匀震荡40 min。反应后迅速将衍生后的标品避光冰水浴，冷却至室温，经0.22μm的过滤器过滤至进样瓶中，按1.3.1的色谱条件方法测定。从图2中可以看出，随着衍生化温度的升高，峰面积逐渐增加，所以选择80℃作为最优衍生化温度。

图2 OPD衍生化温度优化图

2.2.2衍生化时间的优化

取1 mL 100μg/mL的标准品溶液加入200μL OPD衍生溶液，在80℃，450 r/min混匀震荡20，40，60，80，100，120，140，160 min。反应后迅速将衍生后的标准品避光冰浴，冷却至室温，经0.22μm的过滤器过滤至进样瓶中，按1.3.1的色谱条件方法测定。从图3中看到，当温度恒定80℃不变，在20～100 min内，峰面积逐渐增加，达到100 min后，峰面积有下降的趋势，所以选择100 min为最优衍生化时间。

2.3样品前处理的优化

取2份同等体积的奶粉溶液，分别加入等体积的酸（1 mol/L甲酸，2 mol/L乙酸）进行水解。结果表明1 mol/L甲酸，80℃，3 h比2 mol/L乙酸，80℃，3 h水解效果更好，所以最终选择1 mol/L甲酸80℃，3小时为样品酸水解条件。

2.4专属性

如图4所示，N-乙酰神经氨酸标准品的出峰时间约在6.3 min左右，并且OPD试剂的峰图对于检测N-乙酰神经氨酸无影响，所以专属性符合要求。

2.5线性关系及检出限

图3 OPD衍生化时间优化图

图4 OPD色谱图（a）；Neu5Ac标品色谱图（b）

以各峰面积为纵坐标(Y)各标准品的浓度(μg/g)为横坐标(X)绘制标准溶液曲线，如图5所示，Neu5Ac的标准曲线为y=0.3588x-0.8002，R 2=0.9994。可以得出标准品在0.2～200μg/g浓度范围内，与峰面积的线性关系较好。检测结果按照三倍信噪比（S/N=3）进行计算，得到Neu5Ac的检出限为0.5μg/g。

图5 N-乙酰神经氨酸的线性关系图

2.6精密度

精密度实验的结果如表2显示，其RSD=1.99%，结果表明仪器精密度良好，符合技术要求。

2.7重复性

重复性实验的结果如表3显示，其RSD=1.30%，表明实验重复性良好。

表2精密度结果

表3重复性结果

2.8稳定性

稳定性实验结果如表4所示，表明衍生物在8 h内稳定，所以分析时应在8 h内完成。

表4稳定性结果

2.9加样回收率

加样回收率实验结果如表5所示，结果显示，高、中、低三个水平Neu5Ac的加标回收率在98%～119%范围内，说明该方法符合要求，准确性较好。

表5 N-乙酰神经氨酸的回收率结果

2.10样品分析

按照上述优化方法对婴幼儿奶粉样品进行处理，以最终优化方法完成的HPLC方法条件对样品进行N-乙酰神经氨酸含量测定。本实验测定6种不同的奶粉，且唾液酸含量如表6所示。从表格中可以看出6种不同奶粉唾液酸含量差距较大，这是因为奶粉中唾液酸含量与奶牛的品种，饮食方式，以及它们的成长环境有着密切的关系。

3结论

本实验通过单因素试验的分析优化方法，确定了N-乙酰神经氨酸的水解方法：将奶粉溶液在1 mol/L的甲酸在80℃下酸解3 h，再加入衍生化试剂邻苯二胺盐(OPD)在80℃下衍生化100 min，然后采用HPLC-FLD进行分析。本实验色谱条件的选择：流动相采用超纯水-乙腈，流速设置为1.0 mL/min，进样体积是10μL，柱温控制在30℃，在此情况下能够得到较好的峰形。并且在该方法下分析了不同种奶粉的N-乙酰神经氨酸的含量，可以看出不同的奶粉唾液酸含量差距较大，这是因为奶牛的饮食方式，奶牛的种类品种，以及奶牛成长的环境有关。这种方法具有步骤简单，快速便捷，定量准确，节省成本的特点，能够为今后N-乙酰神经氨酸的含量检测研究提供参考依据。

表6 6种不同的奶粉中Neu5Ac含量