桥本氏甲状腺炎实验模型构建研究进展＊

孙伯菊，吴丽丽，秦灵灵，张程斐，吴 悠，秦 帅，王明慧，刘铜华

（1. 北京中医药大学第二临床医学院 北京 100028；2. 北京中医药大学科技处 北京 100028；3. 北京中医药大学中医学院 北京 102488；4. 北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室 北京 100028；5. 成都中医药大学第一临床医学院 成都 611137；6. 陕西中医药大学第一临床医学院 陕西 712046）

自身免疫性甲状腺炎（Autoimmune thyroiditis，AIT）属于自身免疫性疾病，其特征性表现为血清中出现针对甲状腺的自身抗体，主要以甲状腺的炎症破坏为主，其中桥本氏甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）最为典型，病理表现为：正常的滤泡结构被浸润的淋巴细胞，浆细胞及其淋巴细胞生发中心广泛取代。甲状腺滤泡分离，呈小片状，滤泡变小萎缩，其内胶质稀疏，纤维化程度不等，间质内可见淋巴细胞浸润[1]，是全世界甲状腺功能减退的主要原因[2]。实验室检查以抗甲状腺球蛋白抗体（anti-Tg）和抗甲状腺过氧化物酶抗体（anti-TPO）升高为主要表现，HT的流行病学调查[3-5]显示其发生主要与年龄、性别、种族有关，目前为止，对于本病尚无针对病因的确切治疗措施，治疗原则一般为纠正甲状腺的功能异常和缩小显著肿大的甲状腺。有文献[6]指出饮食中的碘、硒、维生素D 和谷蛋白会影响HT 的发生和发展，因此在临床治疗过程中，应考虑饮食的辅助治疗作用。

实验模型的建立对于探索疾病的发生机制及治疗效果具有重要的意义，而对于HT 的实验模型构建，目前多采用实验性动物模型，即研究者通过物理、化学和生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身的一定损害，出现某些类似人类疾病时的功能[7]。对于HT 的细胞实验模型选择，目前多选用甲状腺滤泡上皮细胞株Nthy-ori3-1进行相关机制研究，现将目前为止HT 实验动物模型的动物选择，模型构建方法及模型评价进行相关综述，并对HT 细胞实验的细胞系选择及机制研究进行综述，为相关基础实验提供参考。

1 模型动物选择

1976 年，出现了第一例经新生小鼠胸腺切除术后诱导的自身免疫性甲状腺炎动物模型，但存在成模率低，稳定性差的特点[8]。1982 年又有学者[9]应用 OS 鸡研究自身免疫性甲状腺炎，OS 鸡会自发发展成具有HT 临床特征及病理学特征的疾病模型。1988 年，开始使用免疫佐剂结合自身甲状腺抗体免疫AUG 品系大鼠，并且发现抗甲状腺球蛋白反应与HT 患者的相似度达90%[10]。2007年以后，选择鼠类作为HT动物模型的技术越发成熟，有研究[11]指出小鼠是构建HT实验模型的绝佳载体，由于甲状腺球蛋白（Tg）是一种已知的小鼠和人类共同的甲状腺自身抗原。通过查阅相关文献[1]，目前构建HT 的动物类型常见选择为：Lewis大鼠、SD 大鼠、NOD 小鼠和 C57 小鼠，并且多为雌性鼠，因本病的流行病学显示女性多发，且女性患病率高达1/30～1/10，与流行病学相一致。具体选择这类品系鼠的原因[12-17]陈述如下：

1.1 雌性Lewis大鼠[16]

此种大鼠来源于Wistar 原种，最先由Lewis 繁殖，它的血清含有高水平的甲状腺素，胰岛素和生长激素，易感染引起自身免疫相关疾病。

1.2 雌性SD大鼠[17]

白色封闭群大鼠，是一农场用Wistar 大鼠培育而成，较Wistar大鼠的适应性和抗病能力强，对性激素敏感性高，可广泛用于生物医学研究。

1.3 雌性NOD小鼠[12]

此种小鼠为“非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷”小鼠，其遗传了自然杀伤（NK）细胞活性相对低的特性，为T 细胞、B 细胞、NK 细胞缺陷的严重联合免疫缺陷动物模型，常用于免疫相关疾病研究。

1.4 雌性C57小鼠[13]

此种小鼠是一种常见的近交品系实验鼠，其主要特性为补体活性高，较易诱发免疫耐受性，故多以转基因鼠模拟人类的基因缺陷类疾病。

2 构建实验性HT模型的方法

2.1 动物模型诱导

HT 的发病机制是机体的自身免疫反应，而构建此疾病的动物模型方法主要是模拟疾病的发病机制而进行构建，使用最多且成模率稳定的模型构建方法是通过皮下注射免疫佐剂并结合口服碘剂。通过阅读文献，将构建HT的实验动物模型总结如下：

2.1.1 免疫佐剂结合碘剂诱导

免疫佐剂有各种形式，具体陈列如下：铝佐剂、油乳佐剂、微生物类佐剂、蜂胶佐剂、左旋咪唑佐剂、脂质体佐剂、中药佐剂及小肽类佐剂等，免疫佐剂可起到增强免疫反应的效力。而诱导HT 动物模型选择的免疫佐剂一般为油乳佐剂（弗氏佐剂），由于油乳佐剂可促进多种抗原产生高效价的抗体，使抗原连续刺激的时间相对延长，抗原接种的剂量减少，抗原接种的次数降低[14]。而过度的碘剂可以促进HT 甲状腺滤泡上皮细胞凋亡，是HT发病的重要诱因[15]。但不同课题组采用此种方法诱导HT 动物模型时，开始诱导的起始时间、皮下注射部位和碘剂的浓度略有不同，具体陈述如下：

王向均等[16]采用雌Wistar大鼠，在适应性喂养1周后，应用高碘水和免疫佐剂相结合的方法，其中碘水的浓度为0.64 g·L-1，完全弗氏佐剂（CFA）充分乳化的猪甲状腺球蛋白（TG）多点皮下注射大鼠的双后足，通过将15 mg TG 溶解于15 ml 磷酸盐缓冲液中，加入15 ml完全弗氏佐剂，并用注射器混合以将猪甲状腺球蛋白充分乳化成油包水样来制备乳剂。每天两次，间隔两天。在第5 周，将不完全弗氏佐剂（IFA）乳化的TG（与完全弗氏佐剂的配制方法相同）多次注入大鼠背部皮下，每周一次，共2 周，作为加强剂。在第7 周结束时，结果显示模型组大鼠甲状腺组织中的TgAb 和TPOAb 浓度显著升高，但成膜率未提及。张程斐等[17]采用雌性Lewis 大鼠，第3 周时采用初次免疫，同样采用TG与弗氏完全佐剂融合成的乳剂，第4-8周时进行加强免疫，采用TG 与弗氏不完全佐剂融合成的乳剂，但是皮下注射部位为大鼠的颈部、背部以及左右下腹部，造模时间为8 周，同时造模鼠饮用含0.064%碘化钠的去离子水直到造模结束，结果显示成模率达100%。邹飞等[18]同样复制了上述造模方法，但其初次免疫时间为第1 周，加强免疫时间为第2 周至第7 周，并且其皮下注射的部位为造模大鼠的背、腹腔、腿、颈，可实现HT 的动物模型造模，具体成模率未提及。唐伟等[19]在进行初次免疫后的第2、3、4 周进行加强免疫，且初次免疫时皮下注射部位为大鼠足垫部，加强免疫时于大鼠四肢内侧皮下多点注射。同时给予0.05%的碘化钠喂养大鼠，结果显示抗原、碘剂结合组效果最好，但成模率未提及。李大鹏等[20]采用碘剂配合TG 免疫的方法，用卢戈氏液配置碘水，小鼠服用碘水3 个月后，进行皮下注射TG 免疫，免疫方法为第1天用完全弗氏佐剂配合TG 溶液皮下注射，第3、7、14天再次以弗氏不完全佐剂配合Tg溶液皮下注射小鼠，只是处死小鼠48 h 前会在小鼠尾静脉注射ConA 以充分激活淋巴细胞。实验也证实应用碘剂与甲状腺球蛋白相结合的方式构建HT 的模型具有可重复性，并且诱导实验性自身免疫性甲状腺炎效果更明显[21]。

2.1.2 单纯性碘剂诱导

碘的摄入量与HT的发病有较大的相关性[20]，对于自身免疫性甲状腺炎来说，碘过量是这种疾病的促发因素[22]。1993 年Mooij等[23]发现高膳食碘摄入会加速导致BB 大鼠甲状腺中局灶性淋巴细胞浸润的发展。细胞实验发现NOD.H-2h4 甲状腺细胞，在非常低（4-8 μM）浓度的碘化钠溶液中培养24 h，显示出高水平（40%-55%）的细胞凋亡[24]。单纯性碘剂诱导HT动物模型的动物选择多为NOD 小鼠，因NOD 小鼠是一种自发的非肥胖糖尿病小鼠，实验证实这种品系的小鼠是HT 的遗传易感宿主，高碘饮食会导致NOD 小鼠甲状腺球蛋白分子的免疫原性增加[25]。研究[26]也发现，在NOD 小鼠的饮水中加入0.05%碘化钠，6-8周左右，小鼠的自身免疫性甲状腺炎的发病率达到100%，并且这种炎症反应会在接下来的3-4 个月内发展为慢性，这种小鼠的HT 模型优点是模型较为稳定，成模率高。缺点是此种小鼠造模周期长，诱导成模过程中若是发生动物死亡情况，会耗费大量的金钱和时间成本。

如Nagayama等[27]在NOD 小鼠的饮用水中加入碘化钠进行HT 的动物模型构建，结果发现碘化钠可引起HT，并且发现放射线会加重小鼠的甲状腺炎。Huaqin等[28]选择0.05%NaI溶液处理NOD 小鼠5周，结果显示，与正常组相比，模型组的TgAb 水平显著增加（P＜0.05）。

2.1.3 单纯性免疫佐剂诱导

TG 水平与 HT 症状呈正相关[29]，在诱导 HT 病的实验动物模型时，多选择弗氏佐剂结合TG 皮下注射诱导。而研究[30]发现，甲状腺过氧化物酶（TPO）作为双重活性部位酶，与HT 病的发生也密切相关。这种建模方式的优点是完全模拟自身免疫性甲状腺炎的发病，缺点是步骤复杂，在不同品系小鼠中的结果存在不一致，且价格昂贵。

研究[31]选用完全弗氏佐剂乳化TG，于第7 天皮下注射到小鼠的尾部，在第14天时用不完全弗氏佐剂乳化TG，再次进行加强免疫，结果显示模型组小鼠的血清中的甲状腺自身抗体（anti-TPO 和anti-Tg）和甲状腺炎程度明显高于对照组。研究等[32]将重组鼠TPO(rmTPO)胞外域在完全弗氏佐剂中以1：1 的比例乳化，注射到8 周龄的C57Bl/6 的雌性小鼠的后足垫和背部皮下。7 天后，用不完全弗氏佐剂中乳化的相同剂量的rmTPO胞外域进行加强注射，结果发现从第21天开始，所有小鼠的血清中可检测到针对rmTPO 的抗体，用rmTPO 免疫小鼠的淋巴结细胞显示出对TPO 刺激剂量的依赖性增殖，并且在第50 天和第90 天处死的小鼠甲状腺组织中显示出不同程度的甲状腺炎，伴随单核细胞浸润和甲状腺滤泡破坏，而且与对照组小鼠相比，模型组小鼠显示出更大程度的甲状腺炎。2006年此团队再次重复了重组鼠TPO(rmTPO)胞外域诱导自身免疫性甲状腺炎的模型构建，研究[33]表明TPO 是形成淋巴细胞性甲状腺炎的自身抗原，并且肽540-559是TPO的免疫性T细胞抗原决定簇。

2.1.4 质粒转染

转染是真核细胞在一定条件下主动或被动导入外源DNA片段而获得新表型的过程[34]。有学者[35]尝试将Tg 质粒cDNA 通过电穿孔的方法将其导入细胞内，以期获得一种甲状腺自身免疫模型。方法为选用8周龄的雌性C3H/Hen 小鼠，将制备好的Tg cDNA 在小鼠麻醉状态下注入小鼠的指定肌肉群中，并施加不同脉冲的电流，结果显示电穿孔促进的cDNA 递送并显着增加了Tg反应性抗体的水平，但未发生甲状腺的淋巴细胞浸润和甲状腺功能减退。这种模型的构建方法优点是可以进行定点诱变，以研究分子不同部位在自身免疫性甲状腺中起的作用，并且不需要使用佐剂。缺点是模型尚不能完全复制疾病，且技术手段尚不成熟。

免疫佐剂结合碘剂诱导，单纯性碘剂诱导，单纯性免疫佐剂诱导和质粒转染四种HT 动物造模方法的优缺点见表1。

2.2 细胞实验模型

HT 的基础实验研究模型多选择动物模型，而关于HT 的细胞研究方面，江苏大学毛朝明课题组选择用以下细胞系进行相关机制研究：人甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-ori3-1。此课题组的细胞研究方法为：通过收集临床HT 患者的血清进行前期相关细胞因子的筛选，然后观察相关因子在此细胞系中的表达情况，并且通过抑制相关因子的表达及过表达相关因子，观察相关细胞因子在HT 患者中的作用机制。如通过此细胞系的研究发现：相关炎性因子[干扰素-γ（IFN-γ），白细胞介素-23（IL-23），IL-1β]可通过影响甲状腺上皮细胞相关通路改善HT 的疾病过程[36-38]。过量的碘会抑制自噬相关蛋白LC3B-II 的表达，并通过上调mTOR 来上调自噬发生。与此相一致，桥本甲状腺炎患者的甲状腺组织中mTOR 的水平较高，而自噬相关蛋白LC3B-II的水平较低，这表明过量的碘与HT的发生密切相关，过量碘会诱导甲状腺上皮细胞的异常自噬[39]。通过此细胞系进行了一系列的机制实验，结果显示此细胞系可用来研究HT 相关病理机制，补充了HT细胞实验的空白。

表1 HT动物模型造模方法比较

3 实验模型评价指标

HT 的临床诊断为甲状腺肿大，甲状腺功能检查显示抗甲状腺球蛋白抗体（anti-Tg）和抗甲状腺过氧化物酶抗体（anti-TPO）显著升高，甲状腺细针穿刺显示甲状腺组织中有大量淋巴细胞浸润及纤维化。动物模型制备过程中，因无法进行动物的甲状腺细针穿刺技术，且无法在动物存活期间进行甲状腺病理切片分析，因此，结合HT 的临床诊断，所以动物模型成模的指标为：动物血清中TgAb 和TPOAb 水平，其中，尤以血清中TPOAb 水平最重要。临床结果也发现TPOAb 的水平与HT 组织病理学呈正相关[40]。存在的问题是，NOD小鼠可以自发产生TPOAb，因此一般无法使用人TPO 作为抗原进行测量。随着技术的发展，有课题组[41]使用重组小鼠TPO作为抗原检测，才成功检测出小鼠血清中的TPOAb。因此，HT疾病模型在动物中的成模评价指标，应以动物血清中的TPOAb水平为主。

4 讨论

综上所述，目前有多种方法可构建HT 基础实验模型。HT 是一种自身免疫性疾病，西医对于此病无确切的针对病因的治疗，而对于此病，中医药的疗效是显著的。但研究相关作用机制需成熟且国际认可度高的实验模型，通过查阅国内外相关文献，目前为止，诱导HT 疾病模型的方法主要为：（1）免疫佐剂结合碘剂诱导。（2）单纯性碘剂诱导。（3）单纯性免疫佐剂诱导。（4）质粒转染。但价格合适，重复性高且成模率好的方法为皮下注射免疫佐剂联合碘剂诱导的方式。而对于实验动物的选择，经历了大小鼠、OS 鸡，最后选择以大小鼠中几种特定品系构建模型，由于大小鼠具有繁殖力旺盛的特点，且可更好的模拟人HT 发病的机制，是最佳的构建HT 疾病模型的动物选择。

对于HT 细胞层面的机制探索，目前选用的主要是甲状腺上皮滤泡细胞株Nthy-ori3-1，对于这方面的研究，江苏大学毛朝明课题组研究较多，其课题组主要是通过临床HT 患者的血清分析，然后再通过细胞株进行相关机制验证。这也为研究HT 细胞层面的研究提供了很好的思路。HT 的实验模型构建是进行科学研究的难点与重点，目前中医药领域对于此病的研究多是临床患者的随机对照试验，而中药疗效的具体作用机制需相关基础实验的补充与完善。构建HT 动物模型还在继续探索完善中，每种HT 模型构建都有各自的优缺点，因此在基础实验过程中，应根据本实验室的实际特点，选择合适的模型构建方法。本文对桥本氏甲状腺炎模型构建的动物选择、模型构建方法及模型评价体系进行了简单综述，为相关科研工作者提供一些思路查找。