基于网络药理学的五子衍宗丸药效机制研究＊

闫京宁，胡 聪，孟祥龙

（1. 山西中医药大学中医临床学院 晋中 030016；2. 山西中医药大学中药与食品工程学院 晋中 030016；3. 江西科技师范大学药学院 南昌 330038）

中药经典古方五子衍宗丸起源于唐代，始载于《悬解录》中，由枸杞子、菟丝子（酒蒸，成饼）、覆盆子（酒浸）、五味子（蒸，研碎）、车前子（扬净，盐炒）五味中药制成，被誉为古今“种子第一方”[1]。在《摄生众妙方》[2]、《证治准绳》[3]及《医学入门》[4]等医书中均有记载。五子衍宗丸具有补益肾气、填精补髓及种嗣衍宗之功[5]。其中枸杞子性平味甘，可作填精补血之用；菟丝子性平味甘辛，甘可作补虚之用，辛则温散阳气，以平补肾中阴阳之气，故此二药共同作为本方君药。覆盆子有补益虚损和收敛固摄之功效；五味子五味俱全，但以酸性为主，因酸甘可化阴，具有收敛固摄和益气生津之功效，此二药温和但不热亦不燥，同协君药泌精养肾、固精缩尿，共同作为本方臣药。车前子属味甘性微寒之品，其甘寒而利，有益于通利水道，同时可泻肾中虚火，其微寒之性可用来制约方中的温热之品，从而使整方补而不滞，涩中有通，为佐药[6]。目前，五子衍宗丸的研究进展大多运用于临床，如邱海明[7]研究了五子衍宗丸对不孕不育男性患者的治疗作用, 研究发现服用五子衍宗丸后的不孕不育患者其精子的密度、精子的活动能力、精液量等明显高于较服用枸橼酸氯米芬胶囊患者，提示在五子衍宗丸对男性的不孕不育, 有着较好的临床治疗效果。庞玉琴[8]用五子衍宗丸治疗子宫发育不良的不孕症100 例, 发现五子衍宗丸能调节月经，增大子宫，对子宫发育不良导致的不孕不育具有较好的治疗效果，其治愈率68%,总有效率89%。周波[9]运用五子衍宗丸加减方治疗一名早泄已婚男性，服用五子衍宗丸加减方21 天后房事时仍易短时间内射精,但腰酸、乏力症状较前稍有减轻，服药33 天后，房事时可控制稍长时间后射精,腰酸、乏力较前明显好转，提示五子衍宗丸对早泄具用较好的治疗效果。陈舜华[10]使用五子衍宗丸治疗一名阳痿已婚男性，主要症状为腰膝酸软, 畏寒, 精神差, 时有失眠、头疼头晕症状。服用子衍宗丸10 剂以后，腰膝酸软症状明显改善, 睡眠好转, 晨有勃起。在较茯苓服用20 剂后有症状消失, 勃起正常, 临床治愈，虽然五子衍宗丸在临床应用中取得了较好的疗效，但对其治疗上述疾病的共性作用机制和药效活性成分的相关研究甚少。本研究基于此而展开对五子衍宗丸药效机制的探讨，为其今后的研究运用开拓新的思路和方向。

网络药理学是基于系统生物学理论，通过选取特定信号节点来进行多成分、多靶点药物分子设计的新学科。其通过中药网络药理学数据库与分析平台检索数据，把生物学网络和药物作用系统、整体地有机结合。因中药复方制剂成分复杂，用一般的实验研究或者分析方法难以实现对其共性作用机制的揭示，而借助中药网络药理学无疑为实现这一点增加了许多可能性[11，12]。本研究基于中药网络药理学方法，试揭示五子衍宗丸关于治疗不育、早泄、阳痿三种疾病的共性作用机制。本文探索了用中药网络药理学方法构建出的五子衍宗丸治疗上述三种疾病的“疾病-靶点-药物”网络、蛋白质相互作用网络及其高频节点分析，接着对基因本体（GO）功能和基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路进行了富集分析，并对其共性作用机制（如高频共性靶点、基因、KEGG 通路等）作出了分析总结，为五子衍宗丸的复方成分、药效机制研究和临床应用提供新的思想与方法。

1 方法

1.1 五子衍宗丸成分搜集

TCMSP 虽然存在一定的局限性如：数据来源信息无法匹配，缺乏动物药及中药复方的信息等，但它囊括了中药药典收录的全部草药的活性成分、关键ADME 性质、类药性、作用的靶点及参与的通路，这些数据都是由研究组成员经过数年的手动验证添加的，其准确性和查全性可靠[13]。通过中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[14]，分别以“菟丝子、枸杞子、覆盆子、五味子、车前子”为关键词检索出五子衍宗丸中的成分。

1.2 筛选活性化合物和靶标蛋白

现行研究对于活性化合物的筛选一般是参考OB（Oral Bioavailability, OB）和类药性（Drug-likeness,DL），标准为 OB 值不小于 30%，DL 值不小于 0.18，本研究以此为基础对化合物进行筛选。

1.3 疾病靶点的筛选

通过在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM，http://www.omim.org/）[15]，人类基因数据库（GeneCards®: The Human Gene Database，https://www.genecards.org/）[16]，分 别 以“不育/Sterility”，“早泄/Premature Ejaculation”，“阳痿/Erectile Dysfunction”为关键词检索与不育，早泄，阳痿相关的基因即为疾病的靶点。

1.4 韦恩图的构建

将药物靶标和疾病靶标分别上传到韦恩图（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）[17]，在 线得到活性化合物与不育、阳痿、早泄的交集基因。

1.5 确定靶标蛋白基因名及构建“化合物-靶点-疾病”网络

通过全球蛋白资源数据库（The Universal Protein Resource, UniProt，https://www.uniprot.org/）[18]、人类基因组数据库（HUGO Gene Nomenclature Committee,HGNC，https://www.genenames.org/）[19]、医学文献检索服务系统（US National Library of Medicine National Institutes of Health, Pub Med，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）[20]检索靶标蛋白对应的基因名，而对“化合物-靶点-疾病”网络的构建则用Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）软件完成。

1.6 蛋白质相互作用网络（Protein-Protein Interaction Networks,PPI）的构建

利用蛋白质相互作用关系数据库（STRING 11.0，https://string-db.org）[21]，将五子衍宗丸与三种疾病的共性交集基因分别上传至STRING 数据库，在线得到五子衍宗丸与三种疾病的蛋白质相互作用网络。

1.7 核心靶点的通路分析

把五子衍宗丸治疗不育、早泄、阳痿的蛋白靶点分别上传至生物学信息注释数据库（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery,DAVID，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）[22]，然后进行基因本体（Gene Ontology, GO）生物学过程、细胞组分以及分子功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析，并运用Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/)软件绘图，让其结果可视化。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选

以1.2 项下相关条件进行检索，得到五子衍宗丸中93个活性化合物，4294个作用靶点。其活性化合物基本信息见表1。

续表

续表

2.2 五子衍宗丸与三种疾病的交集基因

按1.3 项下，依照每种疾病的相关检索条件从OMIM 数据库与GeneCards 数据库去在线筛选相关基因并进行合并，得出三种疾病的相关基因靶点。其数目依次为：不育的26390 个相关基因、阳痿的690 个相关基因、早泄的563个相关基因。

按1.4 项下，把药物靶标和疾病靶标分别上传到韦恩图（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htm），在线得到活性化合物与不育、早泄、阳痿的交集基因，数目依次为：不育139个、早泄77个、阳痿55个，见图1，三种疾病交集基因见附表1；共性交集基因数目为20个，见表2。

2.3 “药物-靶点-疾病”交互网络的构建

按1.5 项下相关操作，借助Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）软件分别构建五子衍宗丸与三种疾病的“药物-靶点-疾病”交互网络，见图2。根据五子衍宗丸与三种疾病的“药物-靶点-疾病”交互网络，总结出55个高频共性化合物，见附表2；分析五子衍宗丸治疗每种疾病的药效化合物所属的类别，见图3。

分析五子衍宗丸与三种疾病的“药物-靶点-疾病”交互网络，得出以槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷甾醇（betasitosterol）等为主的55个高频共性化合物，对其药效机制的一些阐述如下：

槲皮素具有抗炎、抗氧化、清除自由基、预防心血管疾病等功效[23]。此外，对生殖系统也有一定的保护功能，可保护睾丸组织的结构和功能维持正常[24]。环境中超标的重金属会引起氧化应激和炎性作用导致机体生殖机能障碍[25]，而槲皮素通过提高抗氧化酶的活性和激活Nrf2-Keap1[26]（Nu-clear 红细胞相关因子结合Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白）通路，使抗氧化物质可以提高抗氧化能力，从而对保护机体的繁殖能力起到很强的作用。山奈酚具有抗氧化、抗炎、抗癌，防治糖尿病、动脉粥样硬化和抑制蛋白激酶等功能[27]，其抗炎活性的作用机制主要包括调节促炎酶的活性和控制炎症相关基因的表达[28]，来抑制氧化应激和炎症反应，防止动脉粥样硬化的发生，从而使内皮血管血液微循环保持良好，起到对生殖系统的保护作用[29]。豆甾醇和β-谷甾醇具有降血脂、抗炎、抗氧化、调节生长和类激素功能等多种作用[30]，经氧化在机体内会转化为类雌激素物质，使血浆中的性激素水平提高，有益于机体生殖系统的发育，增强机体繁殖性能，还可降低血浆中生殖类固醇激素的水平，这样性腺产生的雌激素水平就会相对提高，从而加速机体的激素代谢水平和改善生殖生长性能[31]。

图1 五子衍宗丸与三种疾病的韦恩（Venn）图

表2 五子衍宗丸与三种疾病的共性交集基因

分析五子衍宗丸治疗不育、阳痿、早泄三种疾病的药效化合物类别图，发现甾体类化合物在上述三种疾病的药效化合物类别比例中分别占42.22%、47.62%、46.51%，可推知，甾体类化合物为五子衍宗丸治疗三种疾病的高频化合物种类，其代表性物质有：α-1-谷甾醇（Sitosterol alpha1）、24-亚甲基-8-羊毛甾烯 醇（24-methylenelanost-8-enol）、岩 藻 甾 醇（Fucosterol）及菜油甾醇（campesterol）等。此外，苯丙素类化合物在治疗上述三种疾病中频率较高，其代表物质有：芝麻素（sesamin）、五味子醇乙（Gomisin）和五味子素C（Wuweizisu C）。

2.4 五子衍宗丸与三种疾病的相互作用核心网络(PPI)的构建和筛选

按2.6 项下相关操作，运用蛋白质相互作用关系数据库（STRING 11.0，https://string-db.org），构建出五子衍宗丸与三种疾病的相互作用核心网络图（PPI），见图4，各节点度值分析见表3，五子衍宗丸与三种疾病的PPI网络图分析，见附表3。

图2 五子衍宗丸与三种疾病的“药物-靶点-疾病”网络

图3 五子衍宗丸治疗三种疾病的药效化合物归类

经对比分析，共得到10 个高频共性靶点。其中，血管内皮生长因子A（VEGFA）在生殖系统各器官血管产生和形成过程中起调节作用，在精子的发生、发育及成熟过程有着重要作用[32]；孕激素受体（PGR）、雌激素受体α（ESR1）和雌激素受体β（ESR2）与子宫内膜容受性相关，可能是导致受精卵着床失败的原因[33]；胱氨酸蛋白酶3（CASP3）与导致男性不育的少精子症、弱精子症相关[34]；白细胞介素6（IL-6）[35]、内皮型一氧化氮合成酶（NOS3）[36]、雄激素受体（AR）[37]和抗氧化酶（SOD1）[38]都与男性生殖功能及其机制有关；抗凋亡基因（BCL2）对生殖系统生精组织有一定的调节作用，对生殖细胞的发育起重要作用[]。

五子衍宗丸与三种疾病的PPI 网络图中心点为血管内皮生长因子A（VEGFA），此外，在其周围环绕的蛋白还有胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、白细胞介素 6（IL-6）、趋化因子配体8（CXCL8）、雌激素受体α（ESR1）、内皮型一氧化氮合成酶（NOS3）等。血管内皮生长因子（VEGF）通过增加血管通透性，刺激内皮细胞分裂、增殖和迁移，促进血管生成[40]，还可利用其特异性受体通过自分泌和旁分泌方法传递细胞间信息，调节生殖系统各器官的血管产生、形成以及细胞功能，如其参与了睾丸Sertoli（滋养）细胞和Leydig（间质）细胞的调节[41]。此外，VEGF 在精子的发生、发育及成熟过程有着关键性作用，与男性生殖系统关系密切[42]；精液中的活性氧含量较高，是导致男性不孕不育的主要原因之一，而有研究发现活性氧引起的精子损伤的程度与细胞色素C、CASP9和CASPS3水平升高呈正相关[43]；IL-6作为一种多功能细胞因子，在女性生殖道和妊娠组织中广泛表达，IL-6 水平的升高常会导致女性不孕、反复流产、早产等，对胚胎和胎盘的发育发挥着调节作用[44]。研究发现CXCL 8、TNF-α 等均能通过升高活性氧水平使精子组蛋白转换异常，进而导致精子缺陷，与男性不孕不育关系密切[45]。有报道称ESR1、ESR2 不仅与子宫内膜异位症显著相关还与精子密度、精子活力和精子形态关系密切[46]。IFNG 作为一种生物活性调节因子，能诱导关键细胞因子集落刺激因子2（CSF2）和白细胞介素6（IL-6）的合成，进而影响女性对精液的免疫反应导致不孕不育[47]。PGR属于核受体家族的一员，其甲基化率的增加会减少基因表达，影响子宫内膜异位症患者的子宫内膜容受性[48]。G6PD 是一种用于氧化应激的细胞保护酶，研究表明G6PD 缺陷的母鼠会导致其胚胎DNA 氧化，出现胎儿死亡和畸形，与不孕、宫内和产后死亡以及致畸的关系密切[49]。

2.5 基因本体（GO）功能富集分析

图5 五子衍宗丸与三种疾病的基因本体（GO）功能富集分析

按1.7 项下，将五子衍宗丸治疗不育、阳痿、和早泄的共性蛋白靶点上传至DAVID 数据库，在线得到五子衍宗丸与上述三种疾病的GO 条目1198 个。借助Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）使其结果可视化，见图5。共筛选出30 条GO 高频共性基因，其中排名前十的生物学过程主要包括：雌性性腺发育（female gonad development）、雌性主要性特征的发展（development of primary female sexual characteristics）、雌性性别分化（female sex differentiation）、性腺发育（gonad development）、主要性特征的发展（development of primary sexual characteristics）、DNA结合转录因子活性的正向调节（positive regulation of DNA-binding transcription factor activity） 、 性 别 分 化 （sex differentiation）、细 胞 数 量 的 稳 态（homeostasis of number of cells）、DNA 结合转录因子活性的调节（regulation of DNA-binding transcription factor activity）和生殖结构发育（reproductive structure development）；细胞组分方面主要包括：膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、膜区域（membrane region）、小凹（caveola）、多巴胺能突触（dopaminergic synapse）、质 膜 筏（plasma membrane raft）、线 粒 体 外 膜（mitochondrial outer membrane）、核 被 膜（nuclear envelope）、细胞器外膜（organelle outer membrane）和外部膜（outer membrane）；分子功能方面主要包括：核受体活性（nuclear receptor activity）、转录活性因子，直接配体调节序列特异性DNA 结合（transcription factor activity, direct ligand regulated sequence-specific DNA binding）、类固醇激素活性受体（steroid hormone receptor activity）、细胞因子结合受体（cytokine receptor binding）、肾上腺素能活性受体（adrenergic receptor activity）、类固醇结合（steroid binding）、细胞活性因子（cytokine activity）、生长因子结合受体（growth factor receptor binding）、g 蛋白偶联胺活性受体（G proteincoupled amine receptor activity）和三磷酸腺苷酶结合（ATPase binding）。

2.6 基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

图6 五子衍宗丸与三种疾病的基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

按1.7 项下，将五子衍宗丸治疗不育、早泄、阳痿的共性蛋白靶点上传至DAVID 数据库，在线得到三种疾病的KEGG 通路数75个。其可视化结果见图6。共得到6 条高频共性KEGG 通路，分别为：白细胞介素-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、流体剪切应力和动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、抗叶酸性（Antifolate resistance）及NOD 样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）。其中出现频次较高的白细胞介素-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）和乏氧诱导因子信号通路（HIF-1 signaling pathway）均能刺激促炎细胞因子（IL-6、IL-8、TNF-α），使其表达水平升高，进而加重炎症反应[50]；胞浆内免疫受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）可在调节自身免疫方面发挥重要作用，如果其激活细胞内信号通路，导致转录反应被激活，最终可能使炎症基因表达而产生炎症反应[51]，而大多数生殖疾病和炎症有一定的关系；雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）会影响雌激素、睾酮、孕酮等性类固醇的合成和配子生成，进而影响生殖[52]；流体剪切应力和动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）对血管内皮细胞以及生殖系统血液微循环有一定影响，因此可能会引发生殖系统疾病，越来越多的证据表明AS（动脉粥样硬化）与炎症有关[53]；抗叶酸性（Antifolate resistance）会影响机体内叶酸对环境雌激素所诱导的生殖系统损伤的保护和改善作用，此外，还可能影响睾丸抗氧化功能、生精细胞凋亡、精子质量和生精小管组织结构[54]。

3 讨论

目前对五子衍宗丸的药效成分已有较为深入的研究，结果发现[55]其活性成分为五味子醇A、车前子胶、菟丝子甙、枸杞多糖、有机酸、维生素C 等，而本研究基于五子衍宗丸治疗不育、阳痿、早泄三种疾病的药效化合物类别图，得出药效化合物种类为：甾体化合物、苯丙素类、黄酮类、醇类以及生物碱，其中甾体化合物含量为42%-48%，苯丙素类化合物含量为11%-15%，黄酮类化合物含量为12%-14%，醇类化合物含量为9%-12%，生物碱含量为9%-10%。对于苯丙素类化合物，其代表性物质为五味子醇乙（Gomisin），它的主要来源为木兰科植物华中五味子，具有益气补虚、滋阴益精、抗氧化、抗衰老等功效[56]。此外，其对曲细精管的发育有益，还能促进精子的发生，对机体的性机能有一定的促进作用[57]。

五子衍宗丸是一个中药复方，组方为枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子五味中药，方中发挥补肾之功的是枸杞子和菟丝子，产生滋精之效的是覆盆子，而可生血的则是五味子，车前子能利尿固精。此方可补益肾气、填精补髓及壮阳生精，用于治疗遗精早泄、阳痿不愈等生殖系统疾病。现代临床上用于治疗不育、早泄、阳痿、肾虚腰疼、尿后余沥、肾病综合征以及糖尿病肾病等。

中药复方药剂在现代临床中有许多应用，也产生了较好的治疗效果，在调理治病方面有着其独特的作用。然而，许多中药复方的成分特征和药效机制暂不明确，在一定程度上成为了中药复方药剂在临床上进行推广的阻碍。因此，只有探明中药复方的药效成分、蛋白靶点和作用机制，再为其创立合适而严格的质量控制标准来保障临床用药的安全有效，加速中药现代化的进程。

中医治病讲究辨证论治，是从整体角度去分析病因、病机，再按“君、臣、佐、使”的方式进行方剂配伍，利用其中多味中药的协同作用来调节机体不平衡状态。以上这些中医药学的思想方法体现了多成分、多靶点和综合调控的理念，其与网络药理学的探究思路很相像，所以，网络药理学和中医药学可以结合起来共同研究，这样也能取得更好的研究成果，现在也有许多用中药网络药理学的成果来研究中药有效成分、预测中药靶点、阐明中药作用机制、开发中药新适应症、合理设计新方等[58]。

传统丸剂五子衍宗丸的现代药理学研究进展很快，利用网络药理学能更好更快的分析其作用机制，有些结论对揭示人类衰老的基本机制有一定促进作用，但是对于五子衍宗丸的配伍机制的研究相对甚少[59]，有待于进一步系统设计临床实验结合中药网络药理学实验得出新成果。

本研究借助中药网络药理学方法，通过建立“药物-疾病-靶点”网络得到五子衍宗丸治疗不育、阳痿、早泄三种疾病的高频共性化合物，再分析每种疾病药效化合物所属类别得出五子衍宗丸治疗上述三种疾病的主要化学成分；通过蛋白质互相作用关系（PPI）网络分析，得到五子衍宗丸治疗上述三种疾病的高频共性靶点；通过基因本体（GO）功能富集分析，得到五子衍宗丸治疗上述三种疾病的GO 高频共性基因；通过基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，得到五子衍宗丸治疗上述三种疾病的KEGG 高频共性通路。对于本研究得到的高频共性化合物、药效成分、作用靶点、基因和通路，选取其中有代表性的进行作用机制的阐述。

4 结论

通过建立“药物-疾病-靶点”网络，得到五子衍宗丸治疗上述三种疾病的55 个高频共性化合物，其中槲皮素和山奈酚频率较高，分析每种疾病药效化合物所属类别，得出甾体类化合物是五子衍宗丸治疗上述三种疾病的主要化学成分；通过蛋白质互相作用关系（PPI）网络分析，得到五子衍宗丸治疗上述三种疾病的10 个高频共性靶点，其中以血管内皮生长因子A（VEGFA）、胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、白细胞介素 6（IL6）和雌激素受体 α（ESR1）等为主；通过基因本体（GO）功能富集分析，得到五子衍宗丸治疗上述三种疾病的30 个GO高频共性基因，其中以雌性性腺发育（female gonad development）和生殖结构发育（reproductive structure development）为主，通过基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，得到五子衍宗丸治疗上述三种疾病的6 条KEGG 高频共性通路，其中以雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）和流体剪切应力和动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）为主。

本研究利用中药网络药理学方法对五子衍宗丸治疗不育、早泄、阳痿的共性作用机制进行了研究与阐述，以期为其药效成分研究和临床应用提供理论依据。

附录

附表1 化合物-疾病交集基因

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附表2 五子衍宗丸与三种疾病的高频共性化合物

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附表3 蛋白相互作用网络（PPI）网络分析