基于网络药理学和分子对接探讨新香冲剂治疗流感的作用机制＊

罗子清 ，唐丽娟 ，刘云涛 ，3，张忠德 ＊＊

（1. 广州中医药大学第二临床医学院 广州 510405；2. 广州中医药大学第二附属医院 广东省中医院 广州510405；3. 广东省中医急诊研究重点实验室 广州 510405）

流感暴发造成的人类健康和社会经济损失仍然是一个全球性的公共卫生问题[1，2]。病毒的侵袭激活肺上皮、内皮细胞迅速产生大量的细胞因子如白介素1(Interleukin 1 Alpha/Beta, IL-1α/β)、白 介 素 6(Interleukin 6,IL-6)、γ 干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factors,TNF-α)、环氧合酶(Cyclooxygenase 2,COX2)等[3]，对机体进行猛烈攻击的现象，称为“细胞因子风暴”。流感患者往往不是死于病毒的直接攻击，机体免疫系统紊乱所引发的“细胞因子风暴”才是流感患者的夺命杀手。“细胞因子风暴”能直接损伤内皮细胞，或招募巨噬细胞和嗜中性粒细胞诱导肺泡上皮-内皮屏障损伤，导致肺泡内的纤维蛋白、红细胞和炎性细胞的蛋白质水肿液累积，进一步减少肺泡的气体交换，引发急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)[4]。流感的严重性在于炎症浸润导致的急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)，可在短时间内引起呼吸衰竭，此为流感患者最常见的死亡原因。支持性护理和抗病毒药物是流感的主要治疗手段，药物当中以神经氨酸酶抑制剂(Neuraminidase Inhibitors,NAIs)[5]，如奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦等最为常用。美国感染病学会流感指南[6]推荐尽早启用NAIs 进行抗病毒治疗，超过48小时后使用NAIs的临床获益将减少，但临床上错过最佳治疗时机的患者不在少数。流感中后期可以出现病毒性心肌炎、病毒性脑炎、脓毒性休克、多器官功能衰竭等严重并发症[7]。传统的抗病毒药物仅针对病毒本身进行打击，如何降低细胞因子水平、改善由于炎症浸润引起的ALI 和ARDS 尚未引起足够重视。使用NAIs是否能减少患者由于免疫紊乱罹患的并发症、减少重症发生率仍缺乏有力的临床证据。此外，流感病毒存在抗原漂移和抗原转化的问题[8]，导致病毒持续变异[9]，这无疑加大了抗病毒药物研发的成本和难度。综上，宿主免疫功能失衡、炎症反应剧烈增加了重症流感患者的不良结局，这使得从减轻炎性损伤、调节免疫、保护宿主的角度出发，研发新型流感药物有其必要性和重要性。

已有研究表明中药抗流感病毒的有效性毋庸置疑，其抗炎、免疫调节以及宿主保护的作用也不容忽视。新香冲剂系全国名老中医周仲瑛教授师法《温病条辨》中的新加香薷饮，以清热解表祛湿法为指导，基于岭南湿热为患的致病特点拟定。后由广东省中医院在岭南道地药材资源基础上，结合岭南地区居民身体素质特点将其发展为院内制剂。新香冲剂由香薷、广藿香、青蒿、扁豆花、黄芩、连翘、鸭跖草、柴胡、前胡共9 味药物组成。周老认为流感的治疗重在“芳香宣透”[9]，因此取香薷作为君药以芳香化湿、祛暑解表，辅以青蒿、黄芩为臣药清透血热，佐以广藿香、扁豆花、鸭跖草、连翘、柴胡、前胡共奏清热祛湿、解表透邪之功。在临床研究中发现，新香冲剂对急性病毒性上呼吸道感染有良好的治疗效果，可明显解热镇痛，改善患者头身困重、乏力等症状，且未见明显不良反应[10-12]。同时周老认为中医对病毒感染疾患的治疗不应单纯针对病毒，更应重视调整人体的整体机能、充分发挥其非特异性治疗作用[13]。周老所强调的“抗病毒”“调机能”双管齐下的思想，与研发兼备抗病毒、抗炎、调节免疫等多效用的流感新药的思想，有异曲同工之妙。因此，本研究基于中医理论、新香冲剂的有效性和安全性，使用网络药理学和分子对接的方法，阐明新香冲剂的物质基础，尝试从多角度探索新香冲剂治疗流感的作用机制，以期将其在临床进一步推广应用。

1 材料和方法

1.1 新香冲剂的成分收集与筛选

新香冲剂由9 味中药组成，分别是香薷、广藿香、青蒿、扁豆花、黄芩、连翘、鸭跖草、柴胡、前胡。基于SymMap 数据库[14](https://www.symmap.org/)搜集以上9味中药的化合物成分，在PubChem 数据库[15](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取成分的Canonical SMILES 号。为了严格甄选新香冲剂的活性成分，首先通过FAF-Drugs4 平台[16](http://fafdrugs4.mti.univparis-diderot.fr/)评价化合物的吸收、分布、代谢和消除(Absorption, Distribution, Metabolism and Elimination,ADME)参数，选取评价为“accept”的成分。再利用TargetNet数据库[17](http://targetnet.scbdd.com/)评价成分的里宾斯基五规则(Lipinski Rules of Five,LR)得分，选取LR得分≥75%的活性成分。

1.2 新香冲剂靶点预测

利用活性成分的Canonical SMILES 号，通过TargetNet 平台预测各成分的靶点，收集Prob=1 的靶点，形成新香冲剂的靶点集。

1.3 流感靶点的获取

为了得到更贴近临床真实情况的流感疾病靶点集，以“influenza”为关键词，检索GEO 数据库[18](https://www. ncbi. nlm. nih. gov/gds/)，选 取 物 种 为“Homo Sapiens”的芯片数据(编号：GSE101702)。该数据集包括了107 个流感样本，和52 个健康人样本。进行GEO2R 分析，选取|logFC|＞1.5，P＜0.05 的靶点，利用GSEA 软件对芯片靶点名称进行注释，利用UniProt 网站[19](https://www.uniprot.org/)筛选人源化靶点，最终形成人类流感疾病的靶点集。

1.4 网络构建及拓扑结构分析

构建新香冲剂中药-成分、成分-靶点网络图，进行网络拓扑结构分析，找出网络中的关键节点。HINT数据库[20](http://hint.yulab.org/)是一个高质量的PPI 数据库，其数据主要来源于高通量测序和经由文献报道的实验。利用 Cytoscape3.6.0 软件[21]，以 HINT 数据库获得的人类疾病基因作为背景网络，分别构建新香冲剂靶点网络和PPI 网络，流感疾病靶点网络和PPI 网络。使用Merge功能，取新香冲剂PPI网络和人类流感疾病PPI网络的交集，提取交集网络，形成新香冲剂靶向流感的核心子网络。对核心子网络进行网络拓扑结构分析，根据连接度(Degree)和介数中心性(Betweenness Centrality)，筛选关键靶点(Hub-target)。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID6.8 在线分析工具[22](https://david.ncifcrf.gov/)对核心子网络的靶点进行GO 分析和KEGG[23]通路富集分析。选择生物过程、分子功能、细胞组分3 个模块，利用Graphpad Prism5.0 绘制条形图；利用OmicShare tool 在线平台(http://www.omicshare.com/tools)绘制通路富集气泡图。

1.6 分子对接验证关键化合物与关键靶点的相互作用关系

基于网络拓扑结构分析甄选出的关键化合物和关键靶点，利用分子对接的方法验证二者的相互作用关 系 。 利 用 ChemBio3D Ultra13.0[24]和 Autodock Tool1.5.6[25]对关键化合物和靶点的结构进行优化，过程包括能量最小化、去除水分子、合并非极性氢。随后利用Vina1.1.2 软件[25]进行盲法对接(Blind Docking)，能量范围(Energy Range)设置为5，精度(Exhaustiveness)为100，输出20 个预测结果。选取其中结合能得分(Affinity Score)最小的对接模型，利用LigPlus1.4[26]、PyMOL1.7[27]软件对其进行可视化分析，明确关键靶点与关键化合物的结合位点和相互作用关系。

2 结果

2.1 新香冲剂的活性成分

从新香冲剂中搜集到了126个满足条件的活性成分。一个中药中包含多个活性成分；同一个活性成分可以存在多个中药当中。在新香冲剂中，至少对应3个或以上中药的活性成分，分别有槲皮素，丁香酚，芹菜素，木犀草素，1,8-桉叶素，山柰酚，广藿香醇，百里香酚，阿魏酸(图1)。

2.2 新香冲剂靶点和流感疾病靶点

TargetNet 成功预测了126 个活性成分的靶点，其中香薷 84 个、广藿香 82 个、青蒿 75 个、扁豆花 35 个、黄芩 97 个、连翘 101 个、鸭跖草 54 个、柴胡 107 个、前胡88 个，除重后总共得到新香冲剂的140 个靶点。芯片分析得到86个流感疾病靶点。

2.3 网络构建及拓扑结构分析结果

新香冲剂中药-成分网络(图1)中包括131 个节点，167 条边；成分-靶点网络(图2)中包括264 个节点，2943 条边。根据节点的连接度调节其形状大小，连接度越大，则节点形状越大，连接度越小，则节点形状越小，连接度越大的节点在网络中的位置越重要。对成分-靶点网络进行拓扑结构分析，连接度排在前9 名的活性成分为芹菜素，木犀草素，阿魏酸，丁香酚，1,8-桉叶素，对香豆酸，咖啡酸，丹皮酚，槲皮素，它们是新香冲剂中的重要活性成分。芹菜素的连接度在所有重要活性成分中排名第1，是整个网络中的关键成分。

新香冲剂靶点网络和流感疾病靶点网络的唯一共同靶点是基质金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP9)，因此 MMP9 为这两个网络中的关键靶点。将新香冲剂PPI 网络与流感疾病PPI网络取交集(图3A)，从而形成核心子网络(图3B)。该核心子网络中有119个节点，921条边。对核心子网络进行拓扑结构分析，筛选出连接度≥8、介数中心性≥0.014 的靶点，分别为热休克蛋白90(Heat Shock Protein 90,HSP90)、细胞分裂周期蛋白37(Cell Division Cycle Protein 37, CDC37)、表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)，它们是整个核心子网络中的关键靶点。

2.4 基因本体和通路富集分析

对核心子网络的119 个靶点进行基因本体(GO)分析，选择P＜0.05的生物过程、分子功能、细胞组分3个模块绘制条形图(图4)。在生物学过程中，涉及了一氧化氮(Nitric Oxide,NO)生物合成过程的正向调节，缺氧反应，Notch信号，IFN-γ介导的信号通路调控，核因子κB 抑制剂 (Inhibitor of NF-κB，I-κB)激酶/核因子 κB(Nuclear Factor kappa-B,NF-κB)信号通路的正向调节，I 型干扰素(Type I Interferons,IFNs)生产的正向调节，细胞对TNF-α 的反应，细胞对过氧化氢的反应，细胞增殖调节，一氧化氮合酶活性的正向调节，EGFR 信号通路的正向调节，病毒过程，IFNs 介导的信号通路的调控，细胞周期，转化生长因子β(Transforming Growth Factor Beta,TGF-β)受体信号通路，细胞凋亡，丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)活性激活，对氧化应激的反应等。在分子功能中，涉及了组蛋白结合，钙粘附素与细胞间粘附的关系，酶结合，p53结合，一氧化氮合酶调节活性，热休克蛋白结合等。在细胞组分中，核染色体，蛋白复合物，核小体，核质等项目排名靠前。

图1 新香冲剂中药-成分网络图

图2 新香冲剂成分-靶点网络图

图3 A.流感靶点PPI-新香冲剂PPI交集B.新香冲剂靶向流感的核心子网络

KEGG 通路分析共获得 51 条通路，以P＜0.05，基因数≥4 为度，显著富集的通路有44 条，与流感疾病显著相关的重要通路12 条(图5)。结果显示，核心子网络的靶点涉及的疾病通路为甲型流感通路。与免疫系统相关的通路有3 条，分别是TLR(Toll Like Receptors,TLR)信号通路，核苷酸结合寡聚化结构域(Nucleotide-binding Oligomerization Domain,NOD)样受体信号通路，RLR(RIG-I like Receptor,RLR)信号通路。涉及信号转导的通路有6 条，分别为低氧诱导因子-1(Hypoxia Inducible Factor-1,HIF-1)信号通路，磷脂酰肌醇 3 激酶( Phosphatidylinositol 3 Kinase ,PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB/AKT)信号通路，叉头家族转录因子(Forkhead Box O,FoxO)信号通路，TGF-β信号通路，Notch 信号通路，NF-κB 信号通路。涉及细胞生长和死亡的通路有2 条，分别为有细胞凋亡，p53 信号通路。

2.5 关键化合物与关键靶点的分子对接结果

基于网络拓扑结构分析可知，芹菜素是成分-靶点网络中的关键成分，MMP9 是PPI 网络中的关键靶点。盲法对接后产生了20 个配体-蛋白结合预测模型，对结合能最低的Mode 1 进行可视化分析(图6、图7)。由亮氨酸、组氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸、苏氨酸等氨基酸残基形成结合口袋，芹菜素与MMP9 的谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、精氨酸之间通过7个氢键结合，形成稳定的结合力，表明芹菜素与MMP9的结合较为紧密。

图4 新香冲剂靶向流感的核心子网络靶点的GO分析

图5 新香冲剂靶向流感核心子网络的靶点KEGG通路富集气泡图

3 讨论

中药复方药味多，成分繁杂，强调君臣佐使的配伍原则，一直是中医药现代化研究的难题。网络药理学基于系统生物学、计算机科学、统计学、药理学等学科，构建复杂网络，从宏观的角度探索生物网络中各要素的相互作用[28]。网络药理学的宏观视野和中医治病提倡的“整体观念”是不谋而合的[29]。分子对接是研究配体与受体之间相互作用，预测其结合模式和亲合力，实现基于结构相似性辅助药物设计的方法[30]。采用网络药理学和分子对接的方法，有望对新香冲剂的复杂组方进行抽丝剥茧的分析，从整体的角度理解其治疗流感的现代药理学内涵。

3.1 新香冲剂对流感的治疗作用

新香冲剂的君药为香薷，臣药为青蒿和黄芩，广藿香、扁豆花、鸭跖草、连翘、前胡、柴胡均为佐使药物。香薷，有发汗解表，化湿和中之功效，临床上主要用于恶寒发热、暑湿感冒等[31]。香薷的主要成分黄酮类是发挥解热抗炎、增强免疫作用的主要成分[32]。经香薷乙醇提取物喂养的小鼠对流感病毒感染有保护作用且肺组织的病毒滴度较低；另外香薷水提物能降低脂多糖致热大鼠的肛温，降低TNF-α、环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)、IL-1β 和过氧化物酶的表达水平，亦能增强体液免疫[33]。青蒿能截疟解暑，用于暑邪发热等。青蒿水提物中的多种成分如总香豆素等，能降温解热，通过下调诱导型一氧化氮合酶蛋白表达，抑制炎症因子的表达[34]。黄芩清热解毒，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤的功效，其提取物能显著抑制流感病毒的活性，诱导T细胞和NK细胞产生IFN-γ，减轻IL-1β 诱导的炎症损伤[35]。本次研究对新香冲剂“君、臣、佐、使”的配伍规律进行了科学的解释。通过成分-靶点网络分析发现，在9种最重要的活性成分中，其中7种来源于香薷，由此体现出香薷的君药地位。青蒿-黄芩的共同靶点集与香薷靶点集有64.8%的共同靶点，说明青蒿、黄芩作为臣药可以协同增强香薷之药效。

图6 芹菜素与MMP9相互作用的二维平面图

图7 芹菜素与MMP9相互作用的三维示意图

新香冲剂成分-靶点网络中的重要成分芹菜素、木犀草素、槲皮素属黄酮类化合物，它们对流感的治疗作用不仅体现在抑制病毒的血凝素蛋白和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的活性，还能保护宿主、降低病毒感染后的免疫炎性损伤。黄酮类化合物的抗病毒和抗炎的分子机制各异[36]。芹菜素通过抑制AKT的磷酸化降低病毒的复制效率[37]，通过阻断NO介导的COX2 表达减轻炎症反应[38]。木犀草素可通过干扰外壳蛋白I复合物表达降低甲型流感病毒的产量[39]，通过调控NF-κB 通路中TGF-β 活化的激酶结合蛋白2(TGF-beta-activated Kinase Binding Protein 2, TAB2)和NF-κB 等因子的表达量，减少下游炎性因子IL-1β、TNF-α 以及 COX2 的转录表达[40，41]，且抑制 MMP9 的分泌[42]。槲皮素、阿魏酸、咖啡酸的抗氧化活性强，能清除自由基，保护宿主细胞免受活性氧诱导的损伤[43-45]。阿魏酸抑制COX2 启动子活性从而降低COX2 的转录表达水平[46]，阻断前列腺素合成从而发挥镇痛作用，抑制血小板聚集继而改善肺部微循环[47]。丁香酚调节钙钠离子通道发挥镇痛作用[48]，抑制巨噬细胞的IL-1β，TNF-α 和 COX2 的 mRNA 表达[49]。1,8-桉叶素是桉树油的主要成分，可以减少由炎症介导产生的粘液，用于气道炎性疾病中改善呼吸困难的症状、改善肺功能[50]。接受1,8-桉叶素作为补充治疗的小鼠存活时间更长，炎症反应更轻，肺指数、病毒滴度和死亡率较低[51]。

EGFR 是新香冲剂靶向流感的核心子网络中的关键靶点，TGF/EGFR 信号通路可增强人类肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞的天然免疫反应[52]，这表明新香冲剂可能靶向EGFR 调控天然免疫治疗流感。GO 分析发现核心子网络靶点涉及的生物学过程有IFNs 的产生和信号通路的调控，KEGG 分析发现了TLR 信号通路、NOD 样受体信号通路、RLR 信号通路等免疫系统相关的通路。以上均佐证了新香冲剂具有调节免疫的作用。KEGG 分析涉及的疾病通路是甲型流感通路，说明新香冲剂对甲型流感有一定的靶向性。

综上，新香冲剂对流感的治疗作用包括：抑制病毒复制增殖，降低细胞因子的表达水平，减轻炎症反应，兼以调节免疫，抗氧化保护宿主细胞，改善肺部微循环，镇痛等。这体现了新香冲剂通过多物质，作用于多靶点，经由多途径治疗流感的特点和优势。

3.2 新香冲剂治疗流感的潜在药靶

本研究发现MMP9是新香冲剂靶点网络和流感疾病靶点网络的直接共同靶点，MMP9 的重要性不言而喻。MMP9 是基质金属蛋白酶家族成员，由宿主的正常肺泡巨噬细胞和粒细胞产生，参与细胞因子介导、中性粒细胞迁移，巨噬细胞分化等生物学过程[53]。MMP9与流感、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等多种急慢性呼吸道疾病密切相关，MMP9 的高表达量和肺功能的低水平呈相关性[54]。甲型流感病毒能诱导MMP9 在巨噬细胞中的高表达[55]，增加MMP9 在血清、肺和心脏中的表达，从而降解细胞外间质，参与流感的病理过程。“甲型流感病毒-细胞因子-胰蛋白酶/基质金属蛋白酶循环”是重症流感患者多器官功能衰竭的重要机制之一[56，57]。因此阻断 MMP9 表达，降低 MMP9 的表达水平，是减轻流感炎症反应、降低流感重症转化率的途径之一。在感染早期，克拉霉素可通过减少心脏和肺的炎性细胞聚集，明显抑制血清中MMP9 的表达[58]。黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1 也能对MMP9 起到间接抑制作用，它是NF-κB 的阳性调节因子，可以降低肺泡巨噬细胞中负调节因子，从而减少MMP9 的表达[59]。治疗流感的方剂，例如由金银花、连翘、板蓝根组成的疏风宣肺方和麻黄、石膏、羌活组成的解表清理方，也有抑制MMP9 的作用[60]。本次研究发现，芹菜素与MMP9可以通过多个氢键紧密结合。新香冲剂组方中有9 种药物，其中5 种含芹菜素，它们分别是香薷、青蒿、黄芩、广藿香、扁豆花。基于此，我们推断新香冲剂的作用途径之一是通过调控宿主细胞MMP9的表达发挥其治疗流感的作用。MMP9 是流感、哮喘等多种呼吸道疾病的重要靶点，芹菜素靶向MMP9 治疗多种呼吸道疾病的具体机制有待深入研究。

尽管本次研究有一些新的发现，但仍然存在局限性。第一，对于免疫低下或免疫缺陷的特殊人群，例如老人、器官移植术后患者、艾滋病人等，基于调节免疫、减轻炎症损伤发挥作用的新香冲剂对该类人群的流感治疗效果难以评价。第二，数据库搜集药物成分时，受限于现有的科研条件，缺失Canonical SMILES 号的化合物没被纳入做ADME 参数评价，这可能会剔除了名称未被规范、但有研究价值的化合物。第三，中药数据库中扁豆花、鸭跖草等冷门生僻的药物成分信息少，不能反映药物的真实全貌，这可能会错失一些新发现。由此引出对未来研究的启示，一是针对病毒本身进行打击的药物靶点仍不失其研究价值；二是需要建立更多信息完善的、高质量的中药数据库，以方便进行中药网络药理学的研究。