基于文献计量学和系统药理学方法探究半夏泻心汤对慢性胃炎的作用＊

杨文娜，郑景辉，徐文华

（广西中医药大学附属瑞康医院 南宁 530000）

慢性胃炎（chronic gastritis，CG）是人类最常见的消化系统疾病之一，临床发病率高，据估计，目前全球范围内有超过一半的人患有慢性胃炎[1]。胃炎中的终身炎症和侵袭性炎症可随着时间（数年或数十年）的推移引起胃粘膜的破坏，导致发生萎缩性胃炎、消化性溃疡或胃癌，具有严重的致死后遗症。慢性胃炎的临床表现以恶心、胃胀胃痛、呃逆、食欲不振、嗳气等为主，其病程长且易反复发作。目前，西医主要采取根除幽门螺杆菌、抑酸、保护胃黏膜、助消化、抗抑郁等药物来治疗本病[2]，临床上收到一定效果，但患者长期服用易产生不良反应，且依从性较差。随着疾病治疗模式的转变，人们越来越意识到中医药（补充与替代疗法）在治疗消化系统疾病中的作用，Dossett 等[3]一项34525 例胃肠道疾病人群调查研究研究显示，在美国约有42%的人使用补充替代疗法，其中排第一位就是植物药治疗，而且80%的人从中获益。

中医药对慢性胃炎的病因病机、辨证分型、治疗方法等有较完善的理论，治疗慢性胃炎优势明显，能显著改善患者临床症状，提高生活质量。本研究通过文献计量学方法，从中国知网和万方数据库上查找用于治疗慢性胃炎的中医药，并对该主题的变化规律和定理进行客观分析，从大框架层面粗略筛选出目前治疗慢性胃炎较广泛的中药材或中医方剂，挖掘其内在的规律和特点，基于此探讨其特征和规律，以为临床上的应用提供理论依据。此外，中医药成分繁多冗杂，传统的药理学研究方法尚不能全面的概括其作用机制，而系统药理学是一门新兴学科，是从分子、网络、细胞到组织、器官等不同水平上研究药物治疗疾病能变化机制，建立药物对于机体的作用从微观（分子、生化网络水平）到宏观（组织、器官、整体水平）的各水平间是相互关联的学问，其系统性、整体性的特点与中医药整体观和辩证论治的原则相符合，为药物复杂作用的研究提供了新思路、新方法和新技术[4]，故本研究运用系统药理学方法来系统分析其作用机理，以期为推广中医药的运用及基础研究提供研究基础和新思路。

1 材料与方法

1.1 检索范围与检索策略

从数据库检索与慢性胃炎相关的文献。文献来源于中国期刊全文数据库（CNKI）和万方数据库，检索时间为数据库建库至今，采用主题词加自由词检索，以“胃炎”“中药”为主题词；以“慢性胃炎”“胃炎”“胃窦炎”“胃脘痛”“胃痛”“痞满”为篇名，各词以“或”相连；篇名和主题词以“且”相连进行检索，文献纳入标准为已正式发表的期刊论文和学位论文。

1.2 提取文献关键词并绘制相关的高频关键词共现图

从中国知网和万方数据库下载检索出来的所有文献，采用应用书目共现分析系统软件-BICOMB 提取检索文献关键词，选取出现频次≥10 以上的关键词作为高频关键词，并对高频关键词进行共现分析。再从高频关键词里筛选出与慢性胃炎相关的疾病（慢性萎缩性胃炎、慢性胃炎、胃痛、浅表性胃炎等）和与中医药（中药复方、中药和中成药）的共现关系，借助Cytoscape 3.6.1 软件分析慢性胃炎疾病与中医药的相关性，得到相关度最大的中药或复方。

1.3 高频方药的有效化学成分筛选以及靶点的预测

从TCMSP 数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/）检索1.2分析得到的高频药物所含有的化学成分，根据药物ADME 性质以建议药物筛选标准：口服生物利用度(Oralbioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug-likeness，DL)≥0.18[5-6]为选择条件筛选出有效活性成分。TCMSP数据库提供的活性成分的作用靶点是采用HIT数据库中包含的实验已验证的药物-靶点组合，而没有实验数据支持的药物-靶点组合采用SysDT 和WES 模型预测来获得药物靶点之间的关系，本研究根据TCMSP 提供的化合物靶点取前10 个代表性靶点，录入UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）和 STRING 数据库（https://string-db.org/）中重新检索取一致性靶点，去除非人源靶点，并转化为Gene Symbol，收集整合得到有效化合物的作用靶点。

1.4 与慢性胃炎发病机制相关的靶点的遴选

从 TTD(https://db. idrblab. org/ttd/)、CTD（http://ctdbase. org/） 、 DiGSeE （http://210.107.182.61/geneSearch/）、OMIM（https://www.omim.org/)和Genecards（https://www.genecards.org/）数据库里检索与慢性胃炎相关的靶基因，将搜索到的靶点进行整合，去除重复靶点。将慢性胃炎相关的靶基因与化合物的作用靶点录入venny 2.1分析服务器，得到二者重叠部分的靶点，认为重叠部分的靶点是高频方药对慢性胃炎的潜在作用靶点,收集重叠靶点进行进一步的网络构建和分析。

1.5 高频方药对慢性胃炎的潜在作用靶点的生物信息学分析

利用STRING 数据库观察潜在治疗靶点的相互作用关系，为了提高所获得数据的可靠性，将PPI（protein protein interaction network，PPI network）作进一步筛选，最小交互分数取0.70（高置信度），得到关键作用靶点和蛋白互作网络图。采用Cytoscape 软件对PPI 进行可视化分析，并借助软件的Network Analyzer 计算平均最短路径（ASPL）、中心度（BC）和度值（Degree）等参数。并依托Cytosacpe 的ClueGO 插件对关键作用靶点进行GO分析和KEGG分析。

1.6 有效化合物与关键作用靶点分子对接

为明确有效化合物被摄入机体后，能否与预测的作用靶点稳定结合进而发挥作用，本研究采取分子对接验证预测的作用靶点与化合物的结合性。从PDB（http://www.rcsb.org/pdb/）数据库中找到1.5 得到的关键靶蛋白的PDBID，从TCMSP 数据库下载对应化合物信息，保存为mol2 格式，然后利用IGEMDOCK 软件进行分子对接，得到分子对接得分数据。

2 结果

2.1 文献检索结果及共现分析

根据检索策略在中国知网、万方数据库检索相关文献，中国知网上检索到2207 篇相关文献，万方数据库检索到5388篇相关文献，下载相关信息后利用书目共现分析系统软件（BICOMB）对两个数据库文献信息进行分析。中国知网2207篇相关文献共提取到11563个关键词，以频次≥10以上的关键词作为高频关键词，统计到有169 个高频关键词，从高频关键词中手动统计出与中医药相关的复方、单味中药和中成药有12项，出现频数及所占比例见表1；万方数据库5388篇相关文献提取到21179个关键词，其中高频关键词有258项，统计出与中医药相关的复方、单味中药和中成药有18 项，详细信息见表1。设定频次阈值≥10 从BICOMB 里提取共现矩阵，手动剔除非相关关键词如疗效、中医药疗法、临床观察、穴位贴敷等，把整理后的中医药(复方、单味中药和中成药)和慢性胃炎（胃炎、胃痛、胃窦炎、痞满、浅表性胃炎等）的共现数据导入Cytoscape 软件进行可视化分析，见图2、图3，网络图中节点表示中医药和慢性胃炎疾病，药与病同时出现的频次用两者连线的粗细来体现，连线越粗，共现频次越大。结果表明，半夏泻心汤在慢性胃炎疾病中相关性是最大的，说明半夏泻心汤是中医药在慢性胃炎疾病的应用中较广泛的复方。

2.2 半夏泻心汤的有效化学成分及靶点的收集和慢性胃炎相关发病靶点的搜集

在TCMSP 数据库共收集到125 个（去除重复化合物后）有效化学成分，其中半夏13 个，黄芩36 个，黄连14 个，人参 22 个，大枣 29 个，干姜 5 个，甘草 23 个（OB≥60%、DL≥0.18），包括黄芩素、黄芩苷、小檗碱、黄连碱、人参皂苷RH2、甘草苷、槲皮素、山奈酚等；对应81个作用靶点，包括MMP1(基质金属蛋白酶1)、CASP（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶）、PTGS（前列腺素内过氧化物酶）、SOD1(超氧化物歧化酶1)、NOS2（一氧化氮合酶2）等，半夏泻心汤的药物-化合物-靶点网状关系图见图3。

2.3 半夏泻心汤潜在作用靶点的PPI 和拓扑属性分析

从 TTD 数据库、CTD 数据库、DiGSeE 数据库、OMIM 数据库和Genecards 数据库里检索与慢性胃炎相关的靶基因，其中CTD 数据库和Genecards 数据库根据系统相关性评分各取前300 个靶点，合并所收集到的靶点并去重后获得497个靶点，经过VENNY 在线分析服务器对疾病靶点和化合物靶点进行交集得到29个重叠靶点，故这29个重叠靶点是半夏泻心汤治疗慢性胃炎的潜在作用靶点。

将29 个潜在作用靶点输入STRING 数据库，选择人为研究机体，并设置为0.7 的高置信度交互分数，得到26 个靶蛋白相互作用信息数据，通过Cytoscape 软件进行可视化分析，PPI 见图4。经过拓扑分析，结果发现AKT1（蛋白激酶）为关键作用靶点，具有最大的度值（Degree）、中心性（Betweenness Centrality）和平均最短路径（Average Shortest Path Length）。

表1 中医药（中药、复方、中成药）的出现频次和百分比表

图1 万方数据库中中医药（中药、复方、中成药）与慢性胃炎疾病（慢性胃炎、胃痛、胃窦炎、痞满等）的相关性图

图2 中国知网数据库中中医药（中药、复方、中成药）与慢性胃炎疾病（慢性胃炎、胃痛、胃窦炎、痞满等）的相关性图

2.4 半夏泻心汤潜在作用靶点的生物信息学分析

图3 半夏泻心汤药物-化合物-靶点关系图

图4 半夏泻心汤潜在作用靶点PPI网络

利用Cytoscape 软件的插件-ClueGO 对半夏泻心汤的关键作用靶点参与的生物学过程和信号通路进行分析。经过Bonferroni 校正P＜0.01，得到50 种生物学过程，大致聚类为9 个方面的：对机械刺激的反应、对细胞凋亡的调控、对干扰素-γ 的反应、对脂质定位的负调节、调节白细胞介素-12的产生、调控不饱和脂肪酸和前列腺素代谢过程、调节平滑肌细胞增殖、对神经递质和活性氧代谢过程、氧化还原酶活性等的调节，见图5。26个靶点富集出50条信号通路（校正P＜0.05），包括：NF-κB 信号通路、HIF-1 信号通路、VEGF信号通路、IL-17信号通路等，详见图6。

2.5 分子对接结果分析

分子对接是依据“锁-钥原理”，将化合物分子放入受体蛋白配体结合位点,依据让两者在几何、能量上匹配的原则而相互识别，通过计算作用力进而预测两者间的结合模式和亲和力，从而进行药物的虚拟筛选[7]，本研究借助分子对接技术帮助预测药物对特定靶标的亲和力及结合特性。IGEMDOCK 是款开源性的分子对接软件,一般用于活性筛选和快速对接，对接准确度较高，IGEMDOCK 提供交互式界面，以制备靶蛋白的结合位点和筛选复合物库，库中的每个化合物都被固定到存储箱中[8]。将受体蛋白和化合物分子信息输入软件后，群体大小（population size）设为200，子代（generations）设为 70，解决方案个数（number of solutions）设为2，得到分子对接结果，在构象搜索过程中，IGEMDock 采用的是经验打分函数，经验评分函数估计使用“结合能=范德华力+氢键”[9]，能量越低，化合物分子与受体结合的作用可能性越大，结合更稳定。对接结果见表2,由表中可知结合能范围在-128.23 kcal/mol 至-70.97 kcal/mol 之间，靶点结合能平均值在-100 kcal/mol 以上，药物对特定靶标的亲和力及结合特性良好，其中结合性最好的是SOD1。

3 讨论

图5 半夏泻心汤的关键作用靶点参与的生物学过程

图6 半夏泻心汤的关键作用靶点富集的信号通路

慢性胃炎属于中医的“痞满”“嘈杂”“胃痛”等范畴，其病因病机主要是饮食不节、久病多瘀、情志内伤，导致湿热中阻或寒邪凝滞、胃络不通郁而发病[10]。中医药治疗慢性胃炎有数千年的历史,且具有独特的优势和广阔的应用前景。半夏泻心汤出自东汉时期张仲景的《伤寒杂病论》，方由半夏、黄芩、黄连、人参、大枣、干姜和甘草七种草本植物组成，具有调和肝脾，消痞散结之功效，是治疗中焦疾病的代表方剂之一。本方临床应用广泛，凡属寒热错杂之痞证、心下痞但满而不痛，或呕而肠鸣下利，中焦气机不转或气机升降失调者，可用此方临证加减治疗。其应用主要集中于消化系统疾病领域，临床常用于治疗功能性消化不良[11]、结肠炎[12]、食管炎[13]、胃炎[14]等，以及其他方面的疾病如糖尿病、糖尿病胃轻瘫、慢性肝炎等用此方也有良好的效果，例如赵昱等[15]临床研究上发现，辛开苦降法（以半夏泻心汤基本方加减）治疗肥胖2型糖尿病安全有效，减肥降脂疗效明显优于对照组滋阴清热组；周燕燕等[16]对比观察半夏泻心汤治疗与常规西药治疗糖尿病胃轻瘫患者，实验表明，半夏泻心汤治疗糖尿病胃轻瘫疗效确切，有利于减轻临床症状，缩短胃排空时间，观察组患者的血清胃泌素指标GAS和SS含量均明显优于治疗前和对照组，差异有统计学意义。

本研究利用文献计量学方法统计出中医药与慢性胃炎相关疾病的频次和相关性，得出半夏泻心汤是中医治疗慢性胃炎运用较广泛的方药。现代临床和药理研究证明半夏泻心汤具有保护消化道黏膜、抗炎杀菌、抗氧化应激、双向调节胃肠功能、调节肠道菌群等作用[17]。虽然半夏泻心汤有一些有效化合物和作用靶点、路径被探索过，但还有很多复杂的生物学机制仍未被揭晓，本研究利用系统药理学方法系统性探讨半夏泻心汤对慢性胃炎的作用机理。

根据分子生物学特性，以类药性和口服利用度对半夏泻心汤所含有的化学成分进行初步筛选，得到125 个能进入机体的化学成分，包括槲皮素、黄芩素、人参皂苷、黄芩苷、小檗碱、甘草苷等，其中很多化学成分已有临床和药理试验证实其有效性，如人参皂苷是人参起主要药理作用的成分，具有抗炎、抗肿瘤作用的活性成分[18]，能通过抗氧化作用和调控与炎症相关的信号通路来干预炎症性细胞因子的产生；黄芩苷[19]和槲皮素[20]能抗炎、抗病毒、抗癌；甘草苷有抗溃疡、抗心律失常、抗肿瘤等药理作用，可用于治疗或预防心律失常、心肌缺血、胃溃疡、肿瘤等疾病。小檗碱具有抗菌、抗肿瘤和抗糖尿病的作用，LIN 等[21]研究报道，小檗碱能抑制或消除胃粘膜幽门螺杆菌感染，因此，可用于治疗幽门螺杆菌引起的慢性胃炎，WU 等[22]证明，小檗碱能通过减弱B细胞激活因子（BAFF）触发的Th17细胞因子反应，对幽门螺杆菌诱导的慢性胃炎产生抗炎作用。综上推测：半夏泻心汤是通过这些组分的协同作用，发挥抗炎、抗氧化、抗病毒等作用干预慢性胃炎的发生发展。

表2 半夏泻心汤关键作用靶点与有效化学成分的分子对接结果

这些化学成分共作用于81 个靶蛋白，其中有29个作用靶蛋白是与慢性胃炎的发病机制相关的，包括MMP1、MMP2（基质金属蛋白酶1、2）、CASP（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶）、PTGS1、PTGS2（前列腺素内过氧化物酶1、2）、SOD1(超氧化物歧化酶1)、NOS2（一氧化氮合酶2）等，对其进行生物学过程分析发现这些作用靶蛋白参与机体对机械刺激的反应、调控细胞凋亡、调节脂质代谢、调控不饱和脂肪酸代谢过程、对神经递质和活性氧代谢过程的调节等，并且是多个作用靶点一同调控，如BAX、CASP3 和CASP8 调控细胞凋亡。同时，这也说明中医药治疗疾病是整体协同多靶向作用的特点。

通过对半夏泻心汤的作用靶点进行信号通路富集分析，得到50 条信号通路，包括NF-κB 信号通路、HIF-1 信号通路、VEGF 信号通路、IL-17 信号通路等。这些通路中很多与慢性胃炎发病机制密切相关。如NF-κB 是炎症反应的一个重要物质，其可以促进多种促炎因子产生，使整个炎症扩大，进而损害靶组织，已有文献[23]表明，半夏泻心汤全方及各组分均能根除Hp并抑制TLRs/NF-κB 信号通路；激活血管内皮生长因子（VEGF）/血管内皮生长因子受体途径，可以启动信号级联，促进内皮细胞生长、迁移和分化，加速肿瘤血管的形成，在慢性萎缩性胃炎和胃癌的发生发展有着重要作用[24]；缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是参与机体氧稳态失衡调节的一个核心因子,当机体处于低氧或缺氧环境下,HIF-1α 可启动其下游基因VEGF，在卒中、组织缺血、炎症、肿瘤的发生和发展中发挥重要作用[25]；IL-17在幽门螺旋杆菌感染引起的炎症反应中起重要作用，除能增强IL-8 的表达外,IL-17 还能调节与胃炎、胃溃疡和胃癌有关的其他分子的表达[26]；综上所述，推测半夏泻心汤通过槲皮素、黄芩苷、人参皂苷、小檗碱等有效成分，调控机体的NOS2、BAX、PTGS1、CASP 等靶蛋白以及 NF-κB 信号通路、HIF-1 信号通路、VEGF 信号通路等信号通路干预慢性胃炎的发生发展。

本研究通过系统药理学系统性的探究半夏泻心汤对慢性胃炎的效应机制，科学地收集和预测半夏泻心汤的有效化学成分和作用靶点，以及所参与生物学过程和信号通路信息，由于中药及其复方所含化学成分多样且复杂,真正的药效物质基础目前还有很多尚未挖掘到,数据库收录的信息尚不全面，有些防治疾病的分子机制也尚未明确，因此，本研究只是基于信息大数据的收集和整理预测，具有一定的局限性和不足，后期仍需到真实世界中进行实验验证。