基于网络药理学探讨菟丝子治疗骨质疏松症的作用机制＊

刘博男，宋 辉，薛 屹，孙向明，胡 扬，李文兰＊＊

（1. 哈尔滨商业大学药学院 哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心 哈尔滨 150076）

骨质疏松(Osteoporosis，OP)是一种以骨密度及骨量下降、骨组织的微结构及超微结构均发生不同程度损害，造成患者骨脆性增加，易于发生骨折为特征的疾病，病症以老年人和绝经后妇女为主要发病人群，主要表现有驼背、腰背疼痛、骨折乃至呼吸功能下降[1]。近年来，伴随我国老龄化加剧，老龄人口数目增加，该病症备受关注。且由于女性绝经后卵巢功能下降，体内雌激素水平显著下降，绝经时间和体质量指数是影响骨质疏松症的最重要的相关因素，因此绝经后妇女易发生骨质疏松[2]。目前，雌激素受体α（ERα）仍是预防绝经后女性骨质疏松的首选靶标[3-4]。因此，充分认识骨质疏松，了解其发病机制，做到有效预防、及时准确治疗，对缓解骨质疏松意义重大。

菟丝子为旋花科植物南方菟丝子（CuscutaaustralisR. Br.）或菟丝子（Cuscuta chinensisLam.)的干燥成熟种子。近年药理研究[5]发现菟丝子对生殖系统、骨代谢、免疫系统等多方面均有良好的药理活性，且其具有清除自由基和抗氧化的作用。据文献[6-8]报道，菟丝子在防治绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、原发性骨质疏松症的临床应用方面均有明显疗效。临床上菟丝子也是常见的用于防治骨质疏松的中药，在众多防治骨质疏松的复方中均有菟丝子的应用，右归丸中菟丝子在养肝的同时兼顾补肾，对降低原发性骨质疏松患者骨折发生率有显著疗效[9]；联合钙片使用后血清中骨钙蛋白（BGP）的活性增高，且25-OHD3、IGF-I 水平得以改善[10]，因此阐明菟丝子治疗骨质疏松的作用机制也可为今后合理用药、联合用药提供参考依据。

中药研究的重点和难点之一是理解中药方剂复杂化学体系与病证生物系统间的作用关系，网络药理学是以多向系统药理学与生物学为基础提出来一种的药物研究新方法，通过建立网络靶标将病证、药物映射于生物分子网络，然后通过软件及专业数据库对病证与药物的关系进行计算、分析与预测，以期发现药效物质基础及其作用机制[11-12]。中药网络药理学可通过筛选中药成分，预测有效成分发挥作用的靶蛋白，分析靶蛋白涉及的信号通路来探讨中药治疗疾病的机制[13]。本研究用网络药理学方法预测菟丝子参与治疗骨质疏松症的分子机制，对菟丝子治疗骨质疏松症的有效成分及对应靶标进行归纳整理，总结出菟丝子“活性成分-靶标-通路”三者之间的联系，为探索菟丝子可能的预防及治疗骨质疏松症的机制提供新思路。

1 资料与方法

1.1 化学成分的获取与活性成分的筛选

从 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 数据库中以“菟丝子”或“cuscuta”为关键词，搜索有关菟丝子所含所有化学成分的信息[14]，并综合筛选活性成分，网址详见表1。同时根据文献报道对筛选后的成分进行补充，通过查阅文献得到菟丝子与治疗骨质疏松高度相关的化合物，对筛选后的成分进行补充，最终确定菟丝子发挥防治骨质疏松症的活性成分。

1.2 菟丝子活性成分作用靶标及骨质疏松症靶标的获取

使用 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 数据库复制并下载化合物靶标信息，获得中药菟丝子活性成分的靶蛋白，筛选有效成分靶标。利用GeneCards、OMIM[15]数据库，检索关键词 Osteoporosis，筛选并导出疾病相关靶标[16]，整理在数据库中收集的与骨质疏松相关的靶标，删除重复靶标并筛选出菟丝子活性成分与骨质疏松的共同靶标，为后期构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的拓扑分析做准备。

表1 数据库及分析平台

1.3 “活性成分-靶标”网络构建与分析

将“1.1”项得到的菟丝子的活性成分和“1.2”项收集的菟丝子活性成分相对应的治疗骨质疏松症的靶标导入软件Cytoscape 3.6.0，构建菟丝子的“活性成分-靶标”网络关系，其中构建的网络图中“节点”（node）表示中药所含活性成分及作用靶标，“边”（edge）表示活性成分与靶标间的关系。

1.4 构建PPI网络

基因或蛋白并不是孤立地发挥作用，通常情况下是与多个基因或蛋白相互影响，这种基因或蛋白之间相互作用构成了PPI 网络。利用String 数据库预测蛋白质之间相互作用[17]。将“1.2”项菟丝子的蛋白靶标导入 String 数据库，限定物种为“Homo Sapiens”即人类，设置隐藏游离靶标，设定蛋白相互作用分值为0.4，获取相应蛋白质-蛋白质间相互作用的关系。

1.5 菟丝子作用于骨质疏松症的GO 富集分析和KEGG通路富集分析

将药物-疾病交集基因导入DAVID 数据库，输入“1.2”项中得到靶基因名称列表，限定物种为“Homo Sapiens”，靶基因名修正为“official gene symbol”，列出得到作用靶标的GO 富集分析及KEGG 通路富集分析，筛选出与骨质疏松疾病相关的生物过程及通路进行深入分析。

2 结果

2.1 菟丝子活性成分分析

搜索 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 数据库，收集到菟丝子的活性成分，参考药代动力学ADME 参数，以口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug likeness，DL）≥0.18 作为筛选条件，筛选同时符合上述条件的活性成分，从数据库中筛选出符合条件的活性成分11 个，包括芝麻素、异鼠李素、β-谷甾醇、苦参碱、槲皮素等，此外通过查阅文献补充得到菟丝子与治疗骨质疏松高度相关的化合物3 个：芹菜素、金丝桃苷、紫云英苷[18-21]。将这14个成分确定为菟丝子发挥防治骨质疏松症的活性成分（表2）。

表2 菟丝子主要活性成分基本信息

2.2 潜在靶标预测

在 TCMSP、TCMID、Symmap、BATMAN-TCM、ETCM 数据库中检索菟丝子活性成分的潜在靶标，去除重复靶标后，共得到126 个潜在靶标，GeneCards、OMIM 数据库中找到与骨质疏松症相关靶标共3 126个。将活性成分对应的潜在靶标与GeneCards、OMIM数据库中与骨质疏松相关靶标的比较，筛选出菟丝子治疗骨质疏松的83个潜在作用靶标（图1）。

2.3 “活性成分-靶标”网络构建

图1 药物-疾病靶标Venn分析图

将菟丝子活性成分和靶标的相互作用关系等信息输入Cytoscape 3.6.0 软件中，构建菟丝子“活性成分-靶标”网络图，由图2 可知，活性成分-靶标间相互作用网络中包含活性成分节点14 个，靶标节点83 个，节点间相互作用关系的边231条。

2.4 靶标间相互作用网络的构建

通过String 数据库获取靶标之间的相互作用关系，设置中选择隐藏游离点，选择相关作用分数为0.4，下载TSV 格式，将数据导入Cytoscape 3.6.0 软件中构建靶标间相互作用网络。利用Cytoscape 3.6.0 绘制蛋白相互作用的图形，由图3可知，经过筛选得到靶标间相互作用的网络共有节点81 个，边814 条。结合现有的研究结果，推测菟丝子防治骨质疏松症可能与白细胞介素-6（IL-6）、胰岛素（INS）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、骨分化特异性转录分子2（RUNX2）、雌激素受体α（ESR1）等靶标有关。

2.5 菟丝子作用于骨质疏松症的GO 功能分析及KEGG通路富集分析

将药物-疾病交集靶标导入DAVID 数据库后，得到GO功能分析表明：83个药物-疾病交集靶标影响了82 个生物学过程（P＜0.05），选取最为显著的20 个生物学过程绘制GO 功能分析图，见图4；菟丝子通过改变DNA 结合转录激活因子活性、RNA 聚合酶II 特异性、辅因子结合、核受体活性等发挥药效。KEGG 富集分析得到91 条通路(P＜0.05)，根据KEGG 富集分析及结合现有研究结果（图5）：PI3K/Akt 信号通路（PI3K/Akt signaling pathway）；肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）；MAPK 信号通路；Wnt 信号通路；胰岛素拮抗信号通路（Insulin resistance signaling pathway）等通路与菟丝子治疗骨质疏松的潜在靶标密切相关，表明菟丝子可能通过多条通路作用于骨质疏松发挥其药效。

图2 活性成分-靶标网络图

图3 菟丝子潜在靶标间相互作用网络图

图4 GO功能分析

图5 KEGG富集分析图

3 讨论

3.1 菟丝子防治骨质疏松症的意义

伴随我国人口老龄化加剧，骨质疏松患者人数逐年递增。且该病常呈现渐进性、隐蔽性，患病后致残率、致死率均较高，因此是危害中老年人健康的重大疾病[22]。古人通过长期的中药应用实践，总结出“肾主骨、生髓”的中医理论，将补肾药用于骨科疾病的治疗；中医理论认为，肾为先天之本，骨骼的生长、发育及衰弱与肾精盛衰紧密相关，骨质疏松症在传统中医理论中为肾虚导致，因此中医治疗骨质疏松以补肾为主[23-24]。菟丝子作为补益肝肾的中药对生殖内分泌系统的调节、治疗绝经后骨质疏松、改善卵巢早衰、保肝明目等方面有着显著的药理活性[25-26]。本研究基于网络药理学的理论基础，借助有关数据库及绘图软件等工具对中药菟丝子治疗骨质疏松的作用机制进行探讨。

3.2 主要成分分析

网络药理学结果表明，菟丝子防治骨质疏松的成分有：槲皮素、山奈酚、金丝桃苷、异鼠李素等14 种成分。研究[27]表明槲皮素可通过抑制细胞衰老进而减少因雌激素缺乏所导致的骨流失，成为治疗绝经后骨质疏松症的一种方法。还可以通过促进骨分化改善骨质疏松症[28]；山奈酚的作用机制可能与抑制骨吸收有关[29]；金丝桃苷可通过 BMP 和 Wnt/β-catenin 信号通路共同促进成骨细胞的增殖及分化[19]。异鼠李素防治骨质疏松症的作用机制则是通过调控RANKL/RANK/OPG 信号通路，同时调控成骨细胞和破骨细胞的功能，改善骨微结构上的破坏，实现防治骨质疏松症[30]。由此可见菟丝子防治骨质疏松症的活性成分是通过不同作用机制生效。

3.3 主要靶标分析

菟丝子和骨质疏松的交集靶基因共83个，与疾病显著相关的靶标有IL-6、骨分化特异性转录分子2（Runx2）、VEGFA 等，经过GO 功能分析出菟丝子治疗骨质疏松的生物学过程，发现涉及DNA 结合转录激活因子活性、RNA 聚合酶II 特异性、辅因子结合、核受体活性等。其中IL-6 可诱导破骨细胞活化增强破骨细胞活性[31]。Runx2 作为成骨分化过程中一个必要的转录因子，适量的Runx2 能提高PI3K 信号通路的活性[32]，VEGF 则可促进内皮细胞增殖及血管生成，加速骨形成及重建过程，通过增加成骨细胞的成骨活性，降低破骨细胞溶骨活性来促进骨形成及增加骨密度[33]。菟丝子活性成分通过调节这些靶标起到有效防治骨质疏松症的作用。

3.4 主要通路分析

经KEGG 富集分析发现了91 条通路（P≤0.05），与菟丝子治疗骨质疏松症的相关通路有PI3K/Akt、MAPK、Wnt等。研究[34]表明PI3K/Akt信号通路在细胞增殖、细胞分化、黏附以及细胞凋亡过程中起重要作用；PI3K/Akt 信号通路能刺激成骨细胞的增殖和分化，也可以抑制成骨细胞凋亡[35]。激活PI3K/Akt 信号通路可使下游关键性控制凋亡的因子如：FoxO1、Bad、Caspase-9、和 GSK-3β 磷酸化，从而起到抗凋亡的作用[36-37]。PI3K/Akt 和 BMP 通路、Runx2、FoxO 信号通路也有着紧密联系，骨形成蛋白(BMPS)作为重要的自分泌和旁分泌生长因子，由成骨细胞合成并释放，在骨形成和骨骼修复过程中起着不可替代的作用[38]。MAPK信号通路在成骨细胞生长发育过程中起着重要作用，研究[39-40]证实MAPK 通过作用于成骨细胞来调节骨形成，激活p38/MAPK 可增强成骨细胞分化和增加骨量[41]。Wnt/β-catenin 信号通路在防治骨质疏松症过程中发挥着重要的作用，软骨细胞的增殖及分化，软骨内骨化，骨痂的吸收、重塑和改建等过程离不开Wnt/β-catenin 信号通路的参与，这些过程可通过上调Runx2 实现[32,42]。菟丝子黄酮能调节去卵巢大鼠Wnt/β-catenin 信号通路相关因子β-catenin、OPG、RANKL、DKK1 的水平，从而增加骨密度，改善骨质疏松症状[43]。KEGG 结果表明治疗骨质疏松的相关信号通路在一定程度上与其他信号通路间存在多种多样的相互作用关系，提示治疗骨质疏松时应在针对局部关键通路的基础上，还需针对疾病产生的原因、疾病发展状态、机体所处环境，进行多系统干预，这也体现了中医药治疗疾病时追求的治病求本、标本兼治的特色，进一步证明中药可对多个靶标、多项通路进行综合干预。

综上所述，本研究采用网络药理学方法预测了中药菟丝子预防及治疗骨质疏松的复杂分子网络关系，结果表明中药菟丝子防治骨质疏松症的活性成分可能有槲皮素、山奈酚、金丝桃苷、异鼠李素等，这些有效成分通过调控IL-6、Runx2、VEGFA、ESR1等靶点控制PI3K/Akt、MAPK、Wnt 等信号通路发挥药效。确定了菟丝子治疗骨质疏松的直接和间接调控靶标，以“有效成分-疾病靶标”为基础分析出其可能的作用机制。为后续机制的探讨和实验设计的优化等提供了重要的理论基础。本文也为相关作用机制的研究提供了思路和方法，尤其是分析中药针对某种特定疾病的作用机制，说明网络药理学具有科学性和指导性，为后续深入探讨菟丝子治疗骨质疏松症的作用机制提供了依据。同时，网络药理学也存在局限性：无法解决药物代谢动力学、时辰药理学等过程中可能发生的动态变化，因此部分预测结果及作用机制还需通过实验考察证实，从而完善中药治疗疾病相关机制的研究。本课题组接下来将考察菟丝子对关键蛋白及基因的调控，深入揭示菟丝子治疗骨质疏松症的作用机制，旨在为菟丝子防治骨质疏松类新药的机制研究及开发利用提供参考。