基于聚类分析及因子分析对急性肠粘膜损伤大鼠背部敏化区域Evans Blue渗出强度及规律的分析＊

林 燊，林 栋＊＊，王芳玲，洪 霖，齐诗仪，莫毓昌

（1. 福建中医药大学针灸学院 福州 350122；2. 华侨大学数学科学学院 泉州 362021）

穴位即腧穴，亦称之为“孔穴”“刺激点”，在《内经》中有“以痛为腧”“以手疾按之，快然乃刺之”的记载，是脏腑-经络关系中的重要环节之一。穴位是人体生理、病理状态呈现于体表皮肤的重要部位，在临床疾病的诊断和治疗过程中，产生敏化现象的穴位具有更为特殊意义[1]。穴位敏化概念自二十世纪八十年代提出后，正逐步成为穴位研究热点之一[2,3]。有研究发现[4]，穴位的功能强弱是随着机体功能变化而动态改变，在“沉寂态”与“激活态”之间转化[5]。而关于体表穴位分布规律的研究，是穴位敏化研究中关注相对较少的薄弱环节，尚欠缺进一步的科学阐释[6]。目前,有关敏化穴位分布规律的研究已取得初步结果，有研究通过观察发现急性心肌缺血模型大鼠的腹部和四肢几乎未见Evans Blue 渗出，而在脾、胃俞、心俞的Evans Blue 渗出点较为密集[7]。同时,亦有研究发现冠心病心绞痛患者体表牵涉痛部位及穴位敏化点的位置分布与脊柱T1～T5 神经节段所支配的皮表区域相关[8]。为进一步探索与分析体表敏化穴位分布特征及规律性，本研究拟观察急性肠粘膜损伤模型大鼠背部Evans Blue 渗出点的分布情况，并通过基于探索性空间统计分析技术的经纬网格计数法以及多元统计分析技术[9]深入探索穴位敏化分布规律。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

本实验采用SPF 级体重为200～220 g 的雄性SD大鼠，许可证号：SYXK（闽）2014-005。每笼6只，给予自然照明、自由饮水和摄食。实验时室温保持恒定。将30 只SD 大鼠按不同芥子油浓度分为5%、7.5%、10%、12.5%、15%浓度，共五组，每组6 只。实验过程中，严格遵循实验动物伦理规范操作，实验结束后过量麻醉处死。

1.2 急性肠粘膜损伤模型制备

造模前动物禁食20小时，不禁水，自由活动，室温保持在（20±1）℃，灌肠前，按摩腹部以刺激排出3-4粒粪便后将大鼠倒置，用18号直头灌胃针由肛门进入大鼠肠道约8 cm，按实验分组注入提前用石蜡油稀释的不同浓度芥子油（5%、7.5%、10%、12.5%、15%）各0.5 ml，注射后保持大鼠倒置姿态1分钟，模型制备完毕[9]。

1.3 Evans Blue注射

各组大鼠在肠道灌注芥子油造模后4 小时注射10%的水合氯醛注射（4 ml/kg）麻醉，先用电动剃毛器除去大鼠背部的被毛，再用脱毛剂去除残留的被毛，操作应尽量避免皮肤损伤造成假阳性点渗出。随后尾静脉注射Evans Blue（5 mg/100 g，50 mg/ml溶于生理盐水中），观察大鼠背部Evans Blue渗出点，其以隐于皮下的淡蓝色渗出点为准，而在表皮颜色鲜艳的渗出点大多是由于实验过程中的体表皮肤损伤导致。研究者分别在造模完成后5小时、10小时、15小时、20小时、25小时五个时间点拍照记录大鼠背部的EB渗出情况[9]。

1.4 经纬网格计数法

1.4.1 动物定标

在鼠台上标定鼻尖、耳根、尾根的位置，将大鼠按标定位置俯卧固定在鼠台上，采用三维支架标定拍摄高度为38 cm，于造模后五个时间点进行拍照。

1.4.2 建立经纬网格坐标系

本研究以大鼠第一胸椎为原点建立平面直角坐标系，在坐标系内构建5 mm×5 mm 的经纬网格（项目组前期研究发现大鼠各棘突间距大约为5 mm）[9]。坐标系中X 轴由原点向左依次设为11、12、……、16，向右设为1、2、……、6；Y 轴由原点向下依次设为A、B、C、D、……、U、V，将大鼠背部区域分为 264 个网格（A1、……、A6、A11、……、A16、……、V15、V16）[9]（见图1）。

1.4.3 计数

图1 建立大鼠经纬网格定标图

将5 mm×5 mm 经纬网格以A1……A6、A11……A16……V15、V16 命名。完整在一个方格内的隐于皮肤之下的Evans Blue渗出点计数为1，参考程斌等研究报道[10]。若Evans Blue 渗出点颜色鲜艳则是假阳性点，由于实验过程中大鼠皮肤损伤所致，不纳入统计；若Evans Blue 渗出点在经纬网格相邻处，跨越两个或多个格子，以记上不记下，记右不记左为原则，对各网格区域内点的统计（见图2）[9]。

1.5 统计学处理

1.5.1 方法一

本研究通过聚类分析中的R 型聚类法（指标聚类）获得与EB 渗出强度相关的“特征网格”，并对该“特征网格”的渗出强度与病情、病程的相关性开展轮廓分析[11]。其中，R 型聚类法主要通过经纬网格构建获得网格坐标及EB 渗出点个数，并将数据录入SPSS后，根据聚类级别得到有意义网格坐标后，还原到大鼠背部网格坐标中。而轮廓分析的统计方法对两组或多组变量均数向量的轮廓开展分析[12]。本研究针对聚类分析中获得的“特征网格”开展随浓度和时间分布的平行轮廓、重合轮廓、水平轮廓检验，检验观察指标的变化趋势是否相同、均数是否相等、是否呈线性相关。

1.5.2 方法二

针对不同时间及不同浓度的EB 渗出强度，逐一开展因子分析，从而获得在不同时间及浓度参数下的EB 渗出强度相关“特征区域”。再对其开展后继的轮廓分析验证，进一步判定其渗出“特征区域”的变化趋势[11]。

图2 Evans Blue渗出计数点

本研究的因子分析及主成分分析的意义，在于进一步开展对敏化位置体表渗出强度的区域分析，相较于聚类分析的单网格特征，因子分析及主成分分析具有强大的空间分辨能力。因子分析法选取累计贡献率大于60%的主成分数为因子数，同时其特征根值必须大于1，并通过旋转变换，寻找最佳公因子。因子分析经多次旋转迭代产生的一个以网格为计数单位的因子，形成不同的因子1、因子2、因子3 等，每个因子内皆有若干个网络坐标，根据可提取因子数中的相关网格坐标组成特征区域，并且还原到经纬网格中分析其分布规律与特征，继而同样采用轮廓分析的方法对上述“特征区域”开展与病情及病程相关的趋势分析。

2 结果

2.1 造模情况

造模后，部分大鼠排脓血便且肉眼可见，部分大鼠造模后自主收缩下肢、舔舐下肢或臀部，部分大鼠出现萎靡倦怠、毛发战栗、对外界反应触碰反应强烈、肛门周围红肿，部分大鼠眼睛、鼻子等部位出血。这说明实验动物急性肠粘膜损伤造模成功，在造模后25小时内5%、7.5%、10%、12.5%、15%芥子油大鼠均存活。

2.2 体表EB渗出点聚类分析结果

根据大鼠背部各个网格所采集的有效Evans Blue渗出点数量输入SPSS数据视图，对所有数据进行R型聚类，得到树状分布图（见图3）。

图3 聚类分析结果树状分布图

根据聚类分析结果，选取图3 全因素聚类分析中最具有特征意义的前4“类”，即如图4 所示的四个“特征网格”，说明这四个点的渗出行为在不同时间及不同浓度的组别中具有较强的特征性。

将其中的网格坐标还原至大鼠背部经纬网格坐标图，可以看出在不同浓度不同时间观察的EB 渗出强度，主要分布于急性肠粘膜损伤大鼠胸腰段的脊柱两侧（见图4）。

2.3 “特征网格”的轮廓分析结果

通过运用轮廓分析验证聚类分析所得四个“特征网格”（S1、N1、O14、L11）随浓度或时间变化而存在的趋势，其结果如图5所示。

上述结果表明，在不同浓度下“特征网格”的EB渗出行为与时间变化的平行轮廓检验结果P＞0.05，说明在不同浓度芥子油下，“特征网格（4 个）”的Evans Blue 渗出行为未呈现时间变化趋势；重合轮廓检验结果P＞0.05，说明“特征网格”在不同时间点的渗出程度相同，无统计学差异。

图4 全因素R型聚类结果与特征网格分布

图5 “特征网格”在各时间点上不同浓度芥子油模型大鼠的EB渗出强度轮廓分析

在不同时间点“特征网格（4 个）”的Evans Blue 渗出行为随浓度变化的平行轮廓检验结果P＞0.05，说明各时间点的“特征网格”的渗出行为未呈现随浓度变化趋势；重合轮廓检验结果P＞0.05，说明“特征网格”在不同浓度下的渗出程度相同，无统计学差异，如图6所示。

2.4 体表EB渗出强度的因子分析结果

因子分析在不同浓度、不同时间结果中存在的“特征区域”见表1，其“特征区域”还原结果如图8、图9。

通过网格坐标还原可发现因子1中各坐标分布具有集中趋势，而因子2 及因子3 的集中趋势减弱呈分散状（如图7所示）。考虑到若干相邻网格集合成的区域且范围不宜太大，所包含有效指标约在3-5 个之间（如表1）。研究发现，所谓有意义因子所组成的“特征区域”，即如因子1 中网格坐标有着有比较典型的“组点成区”的趋势，而该趋势在因子2 与因子3 中则不存在。

按上述方法，在不同浓度、不同时间点下的“特征区域”结果如图8、图9所示。

2.5 “特征区域”的轮廓分析结果

通过轮廓分析验证因子分析结果所得“特征区域”随浓度或时间变化的趋势，其结果如图10、图11所示。

上述结果表明，不同浓度下Evans Blue 渗出特征区域在不同时间中的变化规律：平行轮廓检验（P＞0.05），表明特征区域EB 渗出行为具有随时间变化的趋势；重合轮廓检验（P＞0.05），表明特征区域随时间变化的EB渗出程度相同，无统计学差异。

上述结果表明，各时间点EB 渗出特征区域在不同浓度下的变化规律：平行轮廓检验（P＞0.05），表明不同浓度下的差值都在一个固定范围内，即特征区域EB 渗出行为具有随浓度变化的趋势；重合轮廓检验（P＜0.05），表明不同浓度下的评分均值不相等，即特征区域EB 渗出程度随浓度变化不相同，其结果具有统计学意义。

图6 “特征网格”在不同浓度芥子油模型大鼠中各时间点的EB渗出强度轮廓分析

图7 5%浓度的渗出区域特征分析

表1 因子分析后不同浓度及不同时间下的“特征区域”

图8 因子分析后不同芥子油浓度下特征区域分布范围

图9 因子分析后不同时间点上特征区域分布范围

图10 特征区域在不同时间点中各浓度芥子油模型大鼠的EB渗出强度轮廓分析

图11 “特征区域”在不同浓度芥子油模型大鼠中各时间点的EB渗出强度轮廓分析

3 讨论

3.1 基于经纬网格计数法的EB 渗出强度体表分布规律研究

现阶段对于病理状态下敏化穴位动态性分布的研究主要有两方面[7,10,13-15]：一方面是按照不同脊柱神经节段分布，观察疾病模型动物体表Evans Blue 渗出点所处神经节段与该节段内Evans Blue 渗出数量，说明当脏腑发生病变，其相应神经节段所支配的皮肤区域出现Evans Blue 渗出点。另一方面是按照传统腧穴分布，观察疾病模型动物背部与四肢区域Evans Blue渗出点，并通过公式“在穴位处出现EB 渗出点的动物只数/模型组的动物只数×100%”得出Evans Blue 渗出在穴位处分布的比例，进而判断脏腑疾病与传统腧穴之间的相关性。然而，现阶段关于穴位敏化的研究尚不能表明具有动态性的敏化穴位[16,17]，虽然已有研究涉及神经生物学效应，而对于体表分布特征的腧穴表述方面研究仍相对欠缺[18,19]。

本研究采用经纬网格计数法统计急性肠粘膜损伤大鼠背部Evans Blue 渗出情况，并结合多元统计分析开展研究。本研究中所使用的经纬网格计数法是基于现代计量地理学中的空间统计分析思路,即空间数据（spatial data）统计分析方法[20]。通过绘图软件建立一个以大鼠背部第一胸椎为原点的平面坐标系，并赋予每个网格相应的坐标名称（如A1、A2），将每一个网格作为一个计数单位。通过经纬网格坐标在大鼠背部Evans Blue 渗出点与大鼠背部体表位置之间构建了可以判断参照分析的二维平面坐标系。本实验基于坐标体系对模型大鼠Evans Blue 渗出点分布特征进行提炼分析，观察各个经纬网格内Evans Blue 渗出点个数（即渗出强度），运用SPSS 22.0统计渗出强度并展开多元统计分析。

(1)基坑的周围具有一个边界效应,即在基坑外的湿陷量量会迅速的减小，而基坑内部中心点沉降量最大，其沉降量沿半径方向较为均匀的减小。

3.2 经纬网格计数法与穴位敏化的“区域性”特征

本研究通过不同浓度、不同时间下的EB 渗出点聚类分析获得特征网格，再通过轮廓分析验证各特征网格随浓度或时间变化的趋势，其结果无明显特异性，说明单一个体的“特征网格”无显著的随疾病病情及病程变化趋势。本研究发现通过聚类分析所得结果仅仅提示穴位敏化可能存在一定趋势性，而通过观察大鼠背部的EB 渗出点分布发现，不仅单个网格（5 mm×5 mm）存在是有意义的，相邻的若干网格组合也可能是敏化阳性区域的分布（面积大于5 mm×5 mm 的多网格组合），即穴区。因此，本研究采用因子分析手段对前期获得的数据，进一步开展了“群”或“类”的统计探究，根据结果汇总因子贡献度及因子系数的差异进行筛选并组成网格“集合”。与单网格点的聚类分析相比，因子分析得到的公因子所表现出渗出行为特点差异显得更为显著。因此，区域性变量将由独立的单个网格组成“集合”，更能突出其渗出行为的特点和规律性，并且Evans Blue 渗出数量随着病情变化而发生动态改变，上述研究揭示了敏化穴位分布的动态性过程，有助于判断渗出行为与脏腑疾病的相关性[9]。

通过多元统计分析表明，“特征区域”存在与浓度相关的变化规律特征，即与疾病病情相关。而区域性变量（集中、范围较大）较之单坐标变量（单个网格）似乎更能体现规律性的渗出特征，尽管现阶段的研究结果仍不足以体现其与病程、病情相关的规律性，但已能从某些区域的分布行为中发现一丝端倪。

3.3 敏化区域与病情的相关性

现今关于穴位敏化的研究大多关注疾病过程中的某一阶段，而对于随病情及病程变化的疾病动态性研究关注较少。敏化穴位的发生不仅与疾病共同存在，而且是疾病变化特征（病情、病程）的主要表现形式之一。有研究者认为敏化穴位的分布规律不仅与疾病病程（时间）相关[21]，还与病情（程度）相关[22]。亦有学者发现在不同病理状态下穴位敏化都能表现出与病情相关的变化关系，并且在疾病过程的不同阶段所呈现的特点有所差异[22]。陈日新等[23]对临床多种常见疾病的热敏灸治疗发现，局部腧穴的热敏发生率会随着疾病的痊愈而下降。程斌等[10]通过动物实验发现急性胃粘膜损伤相关的体表EB 渗出点与内脏神经节段分布高度相关，并且EB渗出呈现与疾病病情相关。

通过还原经纬网格坐标所获得“特征区域”，可能是急性肠粘膜损伤有关的敏化穴位分布区域，本研究接着通过轮廓分析进一步分析“特征区域”是否存在随浓度或时间变化而变化的趋势。研究发现，“特征区域”在不同时间点存在随浓度变化的趋势，且变化程度不相同，而在不同浓度下随时间变化的趋势及变化程度尚不显著。结果表明，芥子油浓度为7.5%时EB 渗出强度在各时间点均可达到峰值。其后随着芥子油浓度增加，Evans Blue 渗出强度回落并呈现较平稳变化趋势。因此，尽管敏化穴位可随病情变化而发生改变，即在疾病的不同阶段或状态下所呈现出不同的敏化状态，但是其敏化进程随疾病状态而存在一个临界值（峰值），达到峰值后即使病情继续加重，其敏化进程也未见显著性变化。

3.4 敏化“特征区域”与穴位分布相关性

腧穴是人体在生理或病理状态下能与相应脏腑结构发生交互并发挥个性和/或共性效应的体表区域[24]。本研究结果表明，急性肠粘膜损伤后大鼠背部EB 渗出点主要集中在大鼠胸段和腰段脊柱两侧（图12 中红色散点），与大鼠腧穴分布（图12 中蓝色阴影）具有一定相关性。通过多元统计分析所得特征区域主要集中分布于大鼠背部T10～T12段与L1～L2段脊柱两侧，其次在上背部T3、T4 段脊柱右侧有分布趋势（如图12），其特征区域分布与大鼠体表穴位[26,27]中的肺俞、脾俞、肾俞定位相近。

4 总结

图12 急性肠粘膜损伤大鼠背部“特征区域”集中分布与常规大鼠穴位比较

本研究通过构建基于经纬网格计数法的大鼠体表定位体系，采用聚类分析及因子分析的研究方法对以网格为最小计数单位的体表区域展开多元统计分析，从而提取及分析体表EB 渗出点的数学分布特征。今后本研究团队将进一步开展与数学计算机学院的多学科交流合作，逐步引入Spatial Data 统计分析技术，开展基于多值预测的体表穴位敏化分布规律研究。