血瘀质非创伤性股骨头坏死与VEGF、NO、Hcy的相关性研究＊

胡星荣，李盛华，周明旺，肖 振，刘一飞，陈彦同，王鹏志

（1. 甘肃中医药大学 兰州 730020；2. 甘肃省中医院 兰州 730050）

股骨头坏死是由于股骨头动脉缺血或中断，导致骨细胞和骨髓成分部分死亡，从而致使股骨头结构改变、塌陷，引发髋关节疼痛及功能障碍的一种难治性骨科疾病[1-3]。也是青年人群（33-38岁）致残和髋关节置换的主要原因[4]。我国现有近700万人罹患该病，男女比例约为2.5:1[5]。其中非创伤性股骨头坏死（Nontraumatic osteonecrosis of femoralhead，NONFH）居第二位，随着对该病发病机制研究的不断深入，出现了血管内凝血紊乱、脂肪栓塞、脂质代谢紊乱、细胞毒性、细胞损伤及基因多态性等多种坏死学说。但由于其发病机制较复杂，仍未能全面阐释其发病机理，由此导致对NONFH 的保髋疗法难以达到理想的效果，课题组前期研究结果显示血瘀质为NONFH 高发体质之一[6]，同时传统中医药防治股骨头坏死的作用逐渐得到众多学者的认可[3,7]，因此研究血瘀质与NONFH 间的内在关系对防治该病具有重要的临床意义，故本研究通过分析NONFH 坏死体积百分比与血瘀质评分及血清指标的相关性，为防治NONFH提供参考。

1 临床资料

1.1 病例诊断及纳入标准

诊断及分期：参照《成人股骨头坏死临床诊疗指南(2016)》和国际骨微循环研究协会（Association Research Circulation Osseous，ARCO）分期系统[3,8]。

纳入标准：①符合诊断标准的股骨头坏死患者（包括接受手术或中医药对症治疗者）；②年龄18-60岁；③愿意接受本次科研调查研究者。排除标准：①诊断为创伤性股骨头坏死的患者；②妊娠或哺乳期妇女，过敏体质者或不能接受本治疗方法者；③既往无合并肿瘤心脑血管疾病或近期感染性疾病者；④近1年应用激素类或大量饮酒者；⑤近期无感染性疾病以及其他严重代谢异常疾病患者；⑥精神病患者、智力障碍者；⑦正在参加其他临床试验的患者。剔除和脱落标准：有下述任何1项者即可排除：①患者依从性差，未能按照要求填写者。②采集项目不完整，缺项多于20%者。③体质分型判定为兼夹体质者。本研究经医院伦理委员会讨论并获得批准，与受试者签订知情同意书。

1.2 建立数据库

股骨头坏死数据库病例来源于甘肃省中医院关节一、二、三科住院患者。对NONFH 患者血瘀质评定分值。（中医体质判定及评分：参照《中医体质分类与判定》标准制订调查表判定中医体质[9]）。

1.3 一般材料

按照随机数生成器软件产生的随机数抽取数据库 中 2018 年 10 月 至 2019 年 10 月 NONFH 病 例 19 例（见表1）。共34髋，左髋坏死2例，右髋坏死2例，双髋坏死15 例。（7 例激素性NONFH 中因类风湿性关节炎激素治疗 4 例，1 例男性，3 例女性，平均年龄 50±4.97岁；因腰椎间盘突出症激素治疗2 例，年龄分别为52、54 岁。2 例为酒精性股骨头坏死患者，饮酒量均＞100 ml/天，饮酒时间均＞10 年，均为男性，年龄分别为48、50 岁。10 例为特发性股骨头坏死患者，6 例男性，4 例女性，平均年龄50.6±4.5岁）。

2 研究方法

2.1 血清指标检测

因NONFH 分布不集中，故指定专职调查者进行病例的收集和血清样本采集。

患者禁食10 h 后，于入院第二天空腹采集5 ml 晨间肘正中静脉血，置于采血管，在2 h 以内，4℃离心机1 500 r/m，离心10 min，吸取血清等量分装于两支1.5 ml EP 管中，贮存于-80℃冰箱中。其中一管采用人ELISA 试剂盒NO、VEGF(江苏省酶免公司)检测血清。另一管使用全自动生化分析仪[日立高新技术（上海）国际贸易有限公司，标准号：YZB/JAP1498-2014，型号：日立LABOSPECT 008 AS]检测血清Hcy（酶循环法）水平。

2.2 CT重建测量股骨头坏死体积

患者仰卧于CT 扫描床上，以飞利浦Brilliance 128排螺旋对双侧髋臼上缘3.0 cm 到大转子顶点下15 cm范围内沿横断面连续扫描。扫描条件：选择软组织窗（前期试验软组织窗较骨窗能保存更多扫描信息，三维重建后拟合度更佳），电压120 kV，像素大小0.43 mm，层厚0.625 mm，共142层，扫描数据以Dicom3.0标准直接存入移动硬盘备用。由关节专科两位副主任医师经双盲法独立评阅CT及X线片，结合病史和临床表现诊断为NONFH。

2.2.1 建模环境

电脑配置：AMDAthlon64 3200+中央处理器、2G内存、15.6 英寸液晶显示器、64M 显存、ATI 8550 显卡、Win7 操作系统；软件：医学3-D 图像生成及编辑处理软件Mimic17.0（Materialise公司，比利时）。

2.2.2 建立几何模型

将DICOM 影像导入交互式医学影像控制系统Mimics17.0 软件（Materialize，Inc.，比利时）。首先经图像定位，使用阈值分割HounsField 将骨骼和软组织分离（见图1）建立蒙板图层；然后通过区域增长选取股骨头正常区域；将该蒙板清除，保留阈值，再使用多层编辑工具从股骨头顶层逐层选取该阈值股骨头正常区域（见图2）；最后，通过蒙板重建Custon 3D 计算方式建立股骨头三维几何模型，同样方法对股骨头坏死区域建模（见图3、图4）。

自动计算生成的坏死股骨头的体积（V坏）和正常区域体积（V正）（见图5），计算总体积（V总）=V正+V坏，单侧NONFH 以患侧的坏死率代表总坏死率，双侧NONFH 以双侧坏死率的平均值代表总坏死率（见表1）。

2.3 观察指标

CT三维重建计算总坏死率（V/V%）（见表1），血瘀质评分值，检测血清NO（μmold·L-1）、VEGF（pg·mL-1）、Hcy（μmold·L-1）。

2.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件分析，总坏死率以百分比（%）表示，血瘀质评分及血清NO、VEGF、Hcy以均数±标准差（）表示。对于计量资料采用Pearson 相关性分析，对于等级资料采用Spearman 相关性分析，P＜0.05差异有统计学意义，P＜0.01差异有显著统计学意义。

图1 阈值分割

图2 正常区域选择

图3 正常区三维建模

图4 坏死区三维建模

图5 坏死体积占比

3 结果

3.1 坏死率与坏死分期的一致性

总坏死率与双侧坏死分期具有明显相关性（P＜0.01，r左=0.655；r右=0.579）（见表1）。表明应用精确总坏死率可以代表股骨头坏死程度，以便后续统计分析。

3.2 总坏死率、血瘀质与各指标的相关性

总坏死率与NO、VEGF、Hcy 具有相关性，根据相关系数r 判断，相关性依次为NO ＞ VEGF＞ Hcy；血瘀质评分与总坏死率也存在一定相关性，但相关度较小（r=0.575）（见表2，图6）。血瘀质与血清Hcy 密切正相关（r=0.824）（见图7），而与NO、VEGF 未见明显相关。

表1 股骨头总坏死率与坏死分期相关性分析（,%）

表1 股骨头总坏死率与坏死分期相关性分析（,%）

注：NONFH 分期与股骨头总坏死率（V/V%）的相关性检验Δ P＜0.01。

P值0.002ΔΔ 0.009ΔΔ相关系数r 0.655 0.579部位左侧坏死率右侧坏死率总坏死率例数17 17 19坏死率（V/V%）29.61±13.12 35.75±17.40 36.40±9.76

图6 坏死率与各指标的相关性比较

表2 总坏死率与各血清指标和血瘀质评分相关性检验（）

表2 总坏死率与各血清指标和血瘀质评分相关性检验（）

注：与股骨头总坏死率（V/V%）的相关性 ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与血瘀质的相关性 *P＜0.01。

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图7 血瘀质与Hcy相关性

4 讨论

NONFH 属于中医“骨蚀”、“骨痹”等病症范畴，因其发病隐匿，现对保髋治疗仍无统一标准，因此对该病的预防尤为重要。而中医药防治NONFH 已被广大学者所接受，通过对高危体质人群进行调体干预，可有效预防NONFH发生。

近年来学者对NONFH 的中医体质与基因多态性关系的研究较为关注，两者对疾病的易感性方面具有相似的理论和研究证据[9-11]。中医体质学说源于《灵枢·阴阳二十五人》，是指人体相对稳定的固有特质，也是人在生长、发育过程中与外环境相适应的个性特征。它与人们的生活习惯、饮食结构差异有较大关系。NO 在体内分布较为广泛，具有舒张血管平滑肌的作用[12]，它与中医体质间存在一定的相关性[13]。研究[10,14]证实：内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的基因多态性携带rs1799983 的t 等位基因显著降低了NONFH 发病风险；而eNOS 的4b/a 多态性的等位基因a 与特发性和继发性股骨头坏死之间也存在显著相关性。VEGF 可促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。Hong 等[15]进行了一项 Meta 分析显示：VEGF 基因的634G/C 多态性与股骨头坏死的发病具有显著关联性。Zhou 等[11]对 1 025 例股骨头坏死患者和 1 730 例健康人群进行了基于NO 和VEGF 2 个基因的多态性Meta 分析，结果显示：具有 VEGF rs2010963 G＞C 和eNOS rs2070744 T＞C 基因的患者更易罹患股骨头坏死。由此可见NO 和VEGF 与股骨头坏死的发病具有密切关系。

Hcy为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中产生的重要中间产物，其浓度维持在较低水平。研究[16]表明：叶酸和VitB12 共同参Hcy 的代谢，大量饮酒或饮食中缺乏叶酸和VitB12 均可致血清Hcy 明显升高。高浓度的Hcy 可使NO 失活，造成血管平滑肌舒张功能减退，导致血管功能障碍[17-18]；同时Hcy 可导致活性氧簇（Eactive oxygen species，ROS）产生的时间依赖性增加，诱导VEGF-VEGFR2-FAK 信号轴激活，使内皮功能修复出现障碍[18]，最终导致股骨头血供中断而坏死。 而Hcy 是由亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因来调控，多项研究[19-20]证实：MTHFR基因C677T位点的多态性与股骨头坏死关系十分紧密。

本研究发现，NONFH 患者的血清Hcy与血瘀质评分呈较强正相关，结合本课题组前期研究结果：血瘀质为 NONFH 的高发体质之一[6]，提示：NONFH 的发生与Hcy 升高有较大关系，Hcy 升高可能是导致血瘀体质的重要原因之一。但此次研究中血瘀质评分和Hcy水平对NONFH坏死率的相关性均较低，推测Hcy增高可能仅是NONFH 的诱因，对NONFH 的进展速度关系较小。

VEGF 在股骨头坏死区域单位体积内含量降低[21]，但本研究表明：血清VEGF 水平随坏死率的增加升高，提示可能股骨头内血管受损总量随坏死体积的增加而增加，出现血清VEGF升高。而NO是否也存在与VEGF相同的机制仍需进一步深入研究。

由此推测，血瘀质NONFH 患者因个人生活和饮食习惯以及自身遗传等影响，可能通过MTHFR 基因调控后血清Hcy 的浓度较其他体质人群更高，激活了ROS-VEGF-VEGFR2-FAK 信号轴，使股骨头局部单位体积内NO、VEGF 水平降低，加剧股骨头血流中断，故较其他体质更易发生股骨头坏死。

本试验通过CT 三维重建计算坏死体积率较ARCO 等级分期能更精确表达坏死严重程度；对于血瘀体质根据评分进行分析较二分类变量更易体现体质的渐变性和兼夹体质。但因NONFH 发病隐匿未收集到早期NONFH病例，结果可能存在偏倚。

综上所述，尽管基因多态性可以预测患病的易感性，但基因调控蛋白的合成两者不在同一层面，具有复杂性，存在多个基因或一个基因的多个位点同时调控一个蛋白，多种蛋白参与股骨头坏死的发病，其研究结果对筛查易感人群仍有局限性。

与此相反，中药对机体功能状态的调整与调节基因表达和对表达的修饰有关，且中药可通过多基因、多靶点改变蛋白性状和功能。益气活血类中药如黄芪、当归为补气血、活血化瘀常用药对，它能够通过调节细胞增殖相关基因cyclin D、c-fos、c-myc 和PCNA，以及细胞外基质代谢相关基因MMP-2、MMP-9、OPN 和凋亡基因Bcl-2、caspase-3、VEGF 等的表达，从而发挥调节血管平滑肌细胞表型和抑制其增殖的作用，具有扩张血管和抗凝血功能[22-23]。对NONFH 的高危体质人群在进行激素治疗，或长期饮酒之人予以益气、活血化瘀中药或食材，可预防该病的发生，但仍需进一步研究。

随着循证医学对中药治疗股骨头坏死临床疗效的再评价和再认识，中医药治疗NONFH 的疗效已得到普遍认可[6,24-25]。在理论方面也有所发展，提出了：从瘀、痰、湿、毒等论治股骨头坏死[26-29]。预期随着理论深入、规范、科学的研究和临床验证，中医药防治股骨头坏死不仅可以改善患者的生活质量，还能减轻经济负担。