黄芪提取液对糖尿病溃疡大鼠Wnt/β-Catenin信号通路调控表皮干细胞增殖分化的影响＊

仇莲胤，阙华发，屈可伸，孙 伟，郭树豫，李 阳

（1. 上海中医药大学 上海 201203；2. 上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032）

糖尿病性溃疡是糖尿病患者常见而又严重的慢性并发症之一，是糖尿病患者致残和致死的主要原因之一，严重影响患者的身心健康及生命质量，是临床亟待解决的难题。顾氏外科是我国著名的中医外科世家，长期致力于慢性皮肤溃疡的治疗，疗效显著。传承顾氏外科学术思想与临证经验，本课题组开展了中医药治疗糖尿病性溃疡全面系统的临床、基础研究，既往课题组一系列的临床实践及实验研究[1-5]，已发现并证实了补虚化瘀复方及其拆方补虚益气生肌中药能够多途径、多靶点、多环节地发挥作用，提高机体修复能力，有效促进创面愈合。本研究在此基础上，以“补虚生肌”治疗原则为指导，采用补虚中药黄芪有效成分提取液，拟从Wnt/β-catenin 信号传导通路及表皮干细胞的角度，探讨其修复糖尿病溃疡创面的作用机制及作用靶点，为中医“肌平皮长”理论提供客观依据，为中医药促进糖尿病溃疡愈合提供新的治疗靶点，为临床治疗提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

雄性 SPF 级 Wistar 大鼠 192 只，8 周龄，体质量160-205 g（上海斯莱克实验动物责任有限公司），实验动物的许可证号：SCXK（沪）2017-0005。本研究涉及的动物实验操作均在上海中医药大学动物实验中心进行，许可证号：SYXK（沪）2014-0008，实验申请经过上海中医药大学动物实验伦理委员会批准，伦理编号：PZSHUTCM19011113。

1.1.2 药物

黄芪注射液10 ml/支（正大青春宝药业有限公司，国药准字Z3302017）。根据文献[6]计算出人鼠等效剂量，以每支注射液相当于原药材20 g 得出观察组用药剂量。观察组黄芪低剂量组、中剂量组、高剂量组生黄芪用药分别为15 g、30 g、60 g，人鼠等效剂量分别为1.35 g·kg-1、2.7 g·kg-1、5.4 g·kg-1，用 药 剂 量 分 别 为0.675 ml、1.39 ml、2.7 ml。

1.1.3 主要试剂与仪器

链脲佐菌素（批号：S0130，美国sigma 公司）；兔抗增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）单克隆抗体（批号：13110）、兔抗β1整合素单克隆抗体（批号：34941）（均为CST 公司）；兔抗角蛋白19（Keratin19，K19）多克隆抗体（批号：1910712-1-AP）、小鼠抗细胞周期蛋白D1（CyclinD1）单克隆抗体（批号：160186-1-Ig）、兔抗β-连环素（β-Catenin）多克隆抗体（批号：51067-2-AP）、兔抗糖原合成激酶-3β（GSK-3β）多克隆抗体（批号：22104-1-AP），鼠抗GADPH 单克隆抗体（批号：60004-1-Ig）（均为Proteintech 公司）；兔抗 C-myc 单克隆抗体（批号：ab32072）、兔抗HistoneH3 多克隆抗体（批号：Ab1971）（均为Abcam 公司）；蛋白Marker（批号：26616，Thermo Fisher Scientific）；ECL 化学发光检测试剂盒（批号：abs920，爱必信生物科技有限公司）；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（批号：P0028，Beyotime 公司）；BCA 蛋白定量试剂盒（批号：PICPI23223，thermo 公司）；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（批号：G2003，谷歌生物）；Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0006，碧云天公司）；cDNA 合成试剂盒（批号：11123ES60）、RealTime-PCR 试剂盒（批号：11123ES60）（均为上海翊圣公司）；血糖仪（稳豪倍易型，美国强生公司）；酶标仪（型号：RT-6100，深圳雷杜生命科学股份有限公司）；电泳仪（型号：1658003，bio-rad 公司）；多功能化学发光成像系统（型号：ChemiScope6000 Pro，上海勤翔科学仪器有限公司）；PCR 仪（型号：ABI7500，ABI公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立及分组

大鼠适应性饲养一周，采用随机数字表法分为正常对照组（32 只）和造模组（160）只。造模组大鼠在禁食12 h后，给予由柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH4.2、0.1 mol·L-1）配制成 1% STZ 溶液，以质量为 60 mg·kg-1单次腹腔内注射，对照组腹腔注射等容积的0.1 mol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠溶液。造模后第2 天、第7 天，尾静脉取血测定空腹血糖，血糖 2 次均＞16.7 mmol·L-1，即成糖尿病大鼠模型[7-8]。每周检测大鼠血糖1 次，饲养8 周后，大鼠异氟烷吸入麻醉，后背部剃毛，用直径20 mm 的塑料瓶盖在造模区（背部靠近腰椎一侧）标记，在无菌条件下，以外科方法作深达深筋膜、直径为20 mm的全层皮肤缺损，形成糖尿病大鼠全层皮肤缺损开放性创面模型。糖尿病造模组再随机分为模型组、黄芪注射液低剂量组（低剂量组）、黄芪注射液中剂量组（中剂量组）、黄芪注射液高剂量组（高剂量组），各40只。

1.2.2 给药和取材

各组于造模后次日开始经口灌胃给药，低、中、高剂量三组予以黄芪提取液灌胃，剂量分别为0.675 ml、1.39 ml、2.7 ml，1 次/d，正常对照组、模型组给予生理盐水灌胃，每次 2 ml，1 次/d，分别于造模后第 7 天、第14 天、第21 天取材。大鼠创面换药均以常规清洁，外敷生理盐水纱布，加盖消毒干纱布，用胶布固定。

每组随机选取10只大鼠观察创面基本情况，测量创面面积，计算创面愈合率，观察至创面愈合结束，统计创面愈合时间。在造模后第7 天、第14 天、第21 天每组分别随机取选取6 只大鼠，采集包含创面内组织及创周皮肤组织并处死大鼠。创面组织部分于-80℃冰箱冻存，用于 RealTime-PCR 及 WesternBlot 检测，部分用于免疫组化染色。

1.2.3 观测指标

1.2.3.1 创面愈合情况

用药后测量创面面积，使用标尺作为标准，固定高度垂直创面使用数码相机拍照，使用Image pro plus 6.0 软件描画创面轮廓，经软件分析转换为面积，得出原始创面面积，每组大鼠分别于造模当天、造模后第3天、第7天、第14天、第21天用此方法拍照记录创面面积，并计算创面愈合率。计算创面愈合率（%）=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%。各组均观察至创面愈合结束，计算创面愈合时间。

1.2.3.2 RealTime-PCR 检测

给药后第7、14、21 天各组创面组织Wnt1、Wnt3a、β-连环素（β-Catenin）、糖原合成激酶3β（GSK-3β）mRNA 表达。按照总RNA 提取试剂盒说明提取总RNA，分光光度计测定RNA 浓度和纯度。Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β、β-actin 的 PCR 引物由上海基科生物化学有限公司设计合成，Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β 基因 ID 号分别为：24881、303181、84353、84027，引物序列见表1。运用逆转录试剂盒进行逆转录，得到cDNA 原液。随后配制qReal-time PCR 反应体系，以SYBRGreen 法进行扩增，扩增程序为95℃ 5 min（预变性），之后95℃ 10 s（变性），55℃ 20 s（退火），85℃ 20 s（延伸），40 个循环扩增完毕。根据Real-time PCR 原始检测结果，按照 2－ΔΔCt相对定量计算公式，计算各样品组织中Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β mRNA的相对表达量。

1.2.3.3 Western Blot检测

采用 Western Blot 检测给药后第 7、14、21 天各组创面组织β-Catenin、GSK-3β、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、C-myc 蛋白表达及β-Catenin 核内表达水平。称取创面组织剪碎研磨后，采用RIPA 裂解液提取组织总蛋白，采用组织匀浆液提取核蛋白，取上清液以BCA 法测定蛋白浓度，而后蛋白样品在95℃变性10 min。各取样品5 μl行SDS-PAGE 电泳分离并转至NC膜，在含5%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h，加入β-Catenin、GSK-3β、CyclinD1、C-myc、GADPH、Histone H3 一抗，4℃孵育过夜，次日将膜拿出在TBST 缓冲液中漂洗3 次/5 min，加入二抗溶液，37℃孵育2 h，TBST洗膜后，取出NC 膜，根据ECL 化学发光检测试剂盒说明，显色、定影，凝胶成像系统成像，其中核蛋白转膜需要使用PVDF膜，分别以GADPH蛋白、Histone H3蛋白作为内参，结果以各组β-Catenin、GSK-3β、C-myc、CyclinD1、β-Catenin入核电泳条带灰度值比值表示。

表1 PCR引物序列

1.2.3.4 免疫组化法检测

采用免疫组化法检测给药后第7、14、21天各组创面组织角蛋白19（Keratin 19，K19）、β1整合素、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）表达。皮肤组织制成切片，再经脱蜡、水化、修复后，加一抗（β1整合素：1：100，PCNA：1：3000，keratin 19：1：500），4℃过夜，洗涤后加二抗，37℃孵育50 min，添加DAB工作液，湿盒孵育40 s，苏木素复染，无水酒精分化、脱水、透明化，封片。显微镜观察，利用Image pro plus 6.0图像分析软件进行测量分析，计算K19、β1整合素、PCNA阳性表达区域的平均光密度值（Average Optical Density，AOD）。

1.2.3.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，实验中计量资料以均数±标准差（x±s）来表示，检验方差齐性，方差齐者采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪提取液对糖尿病大鼠创面愈合率的影响

与正常对照组比较，模型组在给药后第3天、7天、14 天、21 天时的创面愈合率明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，高剂量组给药后第14、21 天时创面愈合率显著提高（P＜0.01），中剂量组则仅在给药后第14天创面愈合率明显提高（P＜0.05），低剂量组在这三个时间点的创面愈合率差异不明显无统计学意义（P＞0.05）；低、中、高各剂量组之间比较，高剂量组给药后第14天创面愈合率高于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。创面愈合情况见图1，表2。

2.2 黄芪提取液对糖尿病大鼠创面愈合时间的影响

与正常对照组比较，模型组创面愈合时间明显延长（P＜0.01）；与模型组比较，仅高剂量组创面愈合时间少于模型组（P＜0.05），余各组差异不明显无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

图1 各组大鼠不同时间点创面愈合情况

表2 黄芪提取液对不同时间创面愈合率的影响（%）

2.3 黄芪提取液对糖尿病大鼠创面组织Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β mRNA表达的影响

与正常对照组比较，模型组创面组织Wnt1、Wnt3a、β-Catenin mRNA 的表达在创面造模后第 7、14、21 天时均明显降低（P＜0.01），GSK-3β mRNA 表达明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，高剂量组创面组织 Wnt1、Wnt3a、β-Catenin mRNA 的表达在给药后第7、14、21 天时增加（P＜0.05），GSK-3β mRNA 表达降低（P＜0.05）。见表4。

表3 黄芪提取液对创面愈合时间的影响（d）

2.4 黄芪提取液对糖尿病大鼠创面组织β-Catenin、GSK-3β、CyclinD1、C-myc 及 β-Catenin 核内表达的影响

与正常对照组比较，模型组创面组织β-Catenin、CyclinD1蛋白表达在创面造模后第7、14、21天时均明显降低（P＜0.01），GSK-3β的表达明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，高剂量组创面组织β-Catenin、C-myc、CyclinD1 蛋白表达在给药后第7、14、21 天时增加（P＜0.05），GSK-3β表达降低（P＜0.05），高剂量组创面组织β-Catenin入核蛋白表达在给药后第7、14天时明显增加（P＜0.01）；各剂量组之间比较，高剂量组创面组织β-Catenin、C-myc、CyclinD1蛋白表达在给药后第7、14、21天时明显高于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01），而GSK-3β表达降低（P＜0.05）。见表5、表6和图2。

表4 黄芪提取液对创面组织Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK-3β mRNA表达的影响（n=6）

2.5 黄芪提取液对糖尿病大鼠创面组织K19、β1整合素、PCNA表达的影响

与正常对照组比较，模型组创面组织K19、β1 整合素、PCNA表达在创面造模后第7、14、21天时明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，中、高剂量组创面组织K19、β1 整合素、PCNA 的表达在给药后第 7、14、21 天时明显增加（P＜0.01）；各剂量组之间比较，高剂量组K19、β1 整合素、PCNA 表达在给药后第 7、14、21 天时明显高于低剂量组（P＜0.01）。见表7、图3。

表5 黄芪提取液对创面组织β-Catenin、GSK-3β、C-myc、CyclinD1蛋白表达的影响（n=6）

表6 黄芪提取液对创面组织β-Catenin核内表达的影响（n=6）

3 讨论

表7 黄芪提取液对创面组织K19、β1整合素、PCNA表达的影响（n=6）

图3 各组给药后第14天K19、β1整合素、PCNA免疫组化染色（×400）

糖尿病溃疡属中医“消渴”、“脱疽”“溃疡”等范畴，中医在治疗糖尿病溃疡方面有着悠久的历史，且疗效显著，积累了丰富的临床经验，总结了“腐祛肌生、肌平皮长”的溃疡愈合规律。顾氏外科第四代传人外科名家唐汉钧教授治疗糖尿病性溃疡主张“补虚生肌”、“化瘀生肌”理论，认为正气虚损，正气不足是发病之本，溃疡难以愈合的根本原因。依据《素问》“治病必求其本”、“虚者补之、损者益之”的理论，确立补虚生肌的治疗法则。中药黄芪味甘，性温，归肺、脾经，甘能益气，温能补虚，有补益脾肺、益气升阳、固表止汗、利水消肿、托疮生肌的功效，被誉为“疮家之圣药”。黄芪长于补脾肺之气，中医理论强调“脾主肌肉”、“肺主皮毛”，脾为气血生化之源，全身肌肉都依靠脾胃运化的水谷精微化生气血来营养，脾旺则正气足，气血生化充足，肌肉得以濡润而丰满；肺输布津液，宣发卫气外达皮毛，充养皮肤，疮面更易愈合。

现代药理学研究[9]证明，黄芪的有效成分主要为黄芪皂苷、黄芪多糖、黄芪总酮等，在改善局部微循环、促进成纤维细胞、合成胶原蛋白、修复角质形成细胞、调节细胞因子等方面起着一定的作用[10]。黄芪注射液由先进工艺从中药黄芪中提取有效成分精制而成，皂苷类、黄酮类、多糖类为其功效的主要物质基础[11]，相较于传统水煎有效成分稳定，杂质较少，且已在临床上广泛应用，基于相关临床研究[12-13]表明，黄芪注射液可显著调节糖尿病皮肤溃疡患者炎症细胞因子及氧化应激物水平促进创面愈合，还能缩短伤口愈合时间，减轻不适症状。因而，本实验选取此中成药试剂进行灌胃药物干预，旨在揭示黄芪促进上皮化，加速糖尿病溃疡创面愈合的机制。在本实验中，糖尿病模型组大鼠创面愈合缓慢，在创面造模后的第3、7、14、21 天创面愈合率明显低于正常对照组大鼠，且创面愈合时间明显延长，而黄芪药物干预组创面愈合率较模型组得到改善，尤其是高剂量组在给药第14、21天差异更为明显，这表明黄芪提取液能有效促进糖尿病溃疡愈合，尤其在创面修复增殖阶段效果显著，且与剂量依赖有一定关系。

糖尿病溃疡创面愈合涉及局部炎症反应、增殖阶段和组织塑形重建这3个密切联系、交互重叠的阶段，其中增殖阶段的血管新生、肉芽形成、上皮化是创面修复的关键环节[14]。已有研究[15]表明，糖尿病创面肉芽生成减少，再上皮化延迟或缺失，创面愈合缓慢。再上皮化障碍是糖尿病溃疡创面难愈合的重要原因之一。表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞，是皮肤组织再生和创伤修复的关键细胞，主动参与创面的修复，促进创面再上皮化，其位于皮肤的基底层，具有无限增殖和分化潜能，是创面再上皮化过程中各层表皮细胞的源细胞，表皮细胞的更新正是通过其向上增殖分化来完成[16-18]。已有研究[19]发现，糖尿病创面愈合过程中表皮干细胞呈现出数量少、活性低的动态变化，影响上皮化过程，导致创面愈合延迟。K19 和β1整合素是目前公认的表皮干细胞特异性相对较高的标记物[20]，以K19 和β1 整合素同时阳性表达来鉴别创周表皮干细胞。PCNA 是用作评价细胞增殖状态的指标，能准确反映细胞生长速度和状态[21]。

Wnt 通路是由Wnt 蛋白及其受体、调节蛋白等组成的信号转导通路，研究[22]认为其参与创面愈合的过程，发挥着调控皮肤及其附属器的发育、促进创面血管新生及上皮重塑的功能。Wnt/β-Catenin 通路是经典Wnt 信号通路，机制较为清晰与表皮干细胞增殖分化关系密切。通常情况下，Wnt/β-Catenin转导信号中启动信号蛋白Wnt 蛋白处于静息状态，皮肤损伤时，Wnt蛋白通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜的相关受体结合，降低GSK3β 的活性，抑制β-Catenin 的磷酸化,，使β-Catenin 在胞内集聚，最后游离β-Catenin进入细胞核内与T 细胞因子（TCF）/淋巴细胞因子（LEF）结合，激活信号通路，启动靶基因C-myc、CyclinD1 等的表达[23]。该经典通路的标志即是β-Catenin 的积累，并向核内转移[24]。β-Catenin 是 Wnt经典信号通路中的核心关键，其在胞质中的含量高低直接影响着核内靶基因的表达，对表皮干细胞增殖分化起一定作用[25]。有研究[26-27]表明，Wnt 及 β-Catenin 表达增强，表皮细胞增殖、分化能力加强，创面愈合速度加快。而已知的Wnt 蛋白家族成员中，能激活经典通路的有 Wnt1、Wnt3a[28]，GSK3β 是决定降解复合体中β-Catenin磷酸化的重要激酶，起着关键性的负向调节作用[29-30]。

本实验在糖尿病溃疡大鼠模型证实，在创面造模后第7、14、21 天，β-Catenin 在糖尿病大鼠创面组织中呈低表达，GSK-3β 蛋白表达增加，CyclinD1、C-myc 蛋白表达下降，β1 整合素、K19、PCNA 表达较正常对照组明显减少，从而进一步表示Wnt/β-Catenin 信号通路表达下调，创面表皮干细胞数量少，增殖能力减弱，这与以往的实验报道结果基本一致[21]。在通过黄芪注射液给药之后，实验结果显示高剂量组大鼠创面组织在给药第 7、14、21 天 Wnt1、Wnt3a、β-Catenin mRNA水平较模型组明显上升，GSK-3β mRNA 水平下降，β-Catenin 与β-Catenin 核内表达水平增加，GSK-3β 蛋白表达下降，下游靶基因C-myc、CyclinD1蛋白的表达较模型组上升，由此说明Wnt/β-Catenin 信号通路活化，β-Catenin 入核激活下游靶基因转录，K19、β1整合素、PCNA 阳性表达较模型组明显增强，进一步说明促进了表皮干细胞的增殖分化，这也是高剂量组大鼠创面愈合率高于模型组，创面愈合时间缩短的内在机制。综上所述，本研究表明黄芪提取液与Wnt/β-Catenin信号通路活化有关，通过对Wnt1、Wnt3a、β-Catenin、GSK3β 的调控，上调β-Catenin、C-myc、CyclinD1 等蛋白起到调节Wnt/β-Catenin 信号通路的作用，从而影响表皮干细胞的增殖分化，加快创面上皮化的进程，加速糖尿病溃疡的愈合。本研究揭示了中药黄芪促进上皮化，加速创面愈合的机制，为糖尿病慢性创面愈合的治疗提供新思路。