姜黄与莪术活血功效差异的物质基础研究＊

谯明鸣 ，熊 亮 ，刘 宇 ，郭 力 ，刘 菲 ＊＊，彭 成

（1. 成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地 成都 611137；2. 成都中医药大学，西南特色药材创新药物成分研究所 成都 611137）

姜黄和莪术为姜科姜黄属（Curcuma）中不同种植物的干燥根茎，其中姜黄来源单一，为姜黄Curcuma longaL.的干燥根茎，是著名的川产道地药材，而莪术有多种基源，为蓬莪术Curcuma phaecocaulisVal.、广西莪术Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang 或温郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling 的干燥根茎[1]，但其中仅蓬莪术属于川产道地药材。因此，本研究着重对两种川产道地药材姜黄和蓬莪术展开研究。两者的功效类似，均可活血行气、通经止痛，但又有所区别。姜黄始载于《新修本草》，主心腹结积，下气；莪术始载于《药性论》，治女子血气心痛，破痃癖冷气。《本草纲目》曰：“姜黄入脾，兼治血中之气；莪术入肝，治气中之血，稍有不同。”《本草经疏》中记载“姜黄，入足太阴，亦入足厥阴经，苦能泻热，辛能散结，故主心腹结积之属于血分者，兼能治气，故又云下气；莪术，入足厥阴肝经气分，能破气中之血，入气药发诸香，主积聚诸气，为最要之药”。今之学者[2]结合古代典籍和临床经验，将活血化瘀中药归为和血、活血、破血三类，其中姜黄归为“活血”类，而莪术归为“破血”类药物，现代《临床中药学》教材[3]亦根据两者功效主治特点将姜黄归为“活血止痛药”，而莪术归为“破血消癥药”，但两者活血功效差异的物质基础尚不明确。

现代研究表明，姜黄与莪术中均已发现了生物碱、黄酮、甾体、单萜、二萜、三萜、姜黄素类等[4-6]各类成分，其中主要成分类型有两类[7]：姜黄素类、倍半萜类。近年来，有研究发现姜黄提取物能不同程度的影响凝血功能[8]、抑制血小板聚集[9]以及抗血栓作用[10]，临床上常用于预防和治疗肿瘤、各种心血管疾病以及痛经、月经不调等妇科疾病[11-14]；莪术提取物也显示出一定的抗肿瘤[15]、抗血小板聚集[16]和抗血栓作用[17]，临床上尤其多用于治疗胃癌、肺癌等各种常见恶性肿瘤疾病[18-19]。姜黄与莪术来源相近，所含化学成分类型相似，现代药理作用亦有相同之处，但临床用药却差异明显，不可混用。前人研究多以姜黄或莪术单味药为研究对象，鲜见将两者同时作为研究对象于同一试验中对比研究的报道，未能系统的阐述两者活血功效差异原因。因此，本实验采用抗血小板聚集试验和舒张离体血管试验比较研究姜黄和莪术中姜黄素类和萜类成分的活性差异，以期阐明两者传统活血功效差异的原因。

1 材料

1.1 仪器

本研究的实验仪器包括：ACUITYTM 超高效液相色谱-SYNAPT G2 四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF-MS，美国Waters 公司），SC-2000 型血小板聚集测试仪（北京赛科希德科技发展有限公司），Allegra X-30R 型超速冷冻离心机（美国Beckman Coulter 公司），优普系列超纯水器（成都超纯科技有限公司），RE-2000A 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器），DZKW-S-4 型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司），AL104 电子天平（瑞士Mettler Toled 公司），4°C 低温冰箱（青岛海尔股份有限公司），M870B5/10 型离体组织灌流系统、ML870 型PowerLab 生物信号采集系统、MLT0201 型张力换能器、LabchartPro 均购自埃德仪器国际贸易（上海）有限公司。

1.2 药材

本研究的药材：姜黄饮片购于四川新荷花中药饮片有限公司，经成都中医药大学药用植物研究室李敏教授鉴定为姜黄Curcuma longaL.的干燥根茎。蓬莪术药材采于四川省崇州市三江镇宋桥村，经成都中医药大学药用植物研究室李敏教授鉴定为蓬莪术Curcuma phaecocaulisVal.的干燥根茎。

1.3 药品与试剂

本研究的药品与试剂：聚酰胺（江苏长丰化工有限公司）；分析纯无水乙醇、枸橼酸三钠（二水）、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、分析纯葡萄糖（Glucose，C6H12O6）、乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tetraacetic Acid，EDTA）、分析纯氯化钙（Calcium Cloride，CaCl2）、分 析 纯 磷 酸 二 氢 钾（Potassium Dihydrogen Phosphate，KH2PO4）、分 析 纯 碳 酸 氢 钠（Sodium Hydrogen Carbonate，NaHCO3）、分析纯氯化钾（Potassium Chloride，KCl）、分析纯氯化钠（Sodium Chloride，NaCl）和分析纯硫酸镁（Magnesium Sulfate，MgSO4）均购自成都市科龙化工试剂厂；阿魏酸钠（上海源叶生物科技有限公司，批号S31124）；0.9%氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司）；腺苷-5′-二磷酸钠盐（批号SLBB1854V）、苯肾上腺素（PHE，批号1000957684）均购自美国Sigma公司。

1.4 动物

新西兰兔，雄性，体质量约2.5 kg；SD 大鼠，雄性，体质量180～220 g，均购自成都达硕动物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2015-030。饲养温度21℃～27 ℃，湿度50%±5%，昼夜光照及通风环境自然调节。实验程序严格按照动物管理章程。

2 方法

2.1 溶液的配制

枸橼酸三钠抗凝剂的配制：称取3.8 g 枸橼酸三钠，加生理盐水溶解，转移至100 mL量瓶中，再加生理盐水定容至刻度，摇匀，即得3.8%枸橼酸三钠溶液。

腺苷-5′-二磷酸钠盐溶液的配制：称取6.40 mg腺苷-5′-二磷酸钠盐于50 mL量瓶中，加入生理盐水定容至刻度，摇匀，即得300μmol/L腺苷-5′-二磷酸钠盐溶液。

阳性药（阿魏酸钠）溶液的配制：称取0.6 g阿魏酸钠于50 mL 量瓶中，加入生理盐水定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为60 mg/mL 阿魏酸钠高剂量溶液。采用二倍稀释法稀释后得30 mg/mL 阿魏酸钠中剂量溶液和15 mg/mL阿魏酸钠低剂量溶液。

K-H 液（Kreb’-Henseleit solution）配制(g)：NaCl，13.87；KCl，0.7；KH＜sub＞2＜/sub＞PO＜sub＞4＜/sub＞ ，0.32；MgSO＜sub＞4＜/sub＞，0.28；NaHCO＜sub＞3＜/sub＞，4.2；Glucose，3.64；EDTA，0.018；CaCl＜sub＞2＜/sub＞ ，0.56，加超纯水至2 L，pH 7.4，现配现用。

2.2 姜黄莪术萜类与姜黄素类成分群的分离与确定

姜黄、莪术药材各2 kg，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液并浓缩得总浸膏。总浸膏用聚酰胺色谱柱经70%甲醇水和100%甲醇洗脱，浓缩后经TLC 和UPLC-Q/TOF-MS 检测，确定姜黄和莪术的不同成分群。

2.3 抗血小板聚集试验

家兔心脏取血，3.8%枸橼酸三钠溶液抗凝（血液:抗凝剂=9:1），收集于离心管中，混匀抗凝剂和血液。血液以800 r/min 离心10 min，取上层血浆；余下部分再以相同的转速和时间离心第二次，取上层血浆与第一次所得血浆混匀，即得PRP（富血小板血浆）。取第二次离心的下层血液，以3000 r/min 离心10 min，取上层血浆即PPP（贫血小板血浆）。

试验分为正常对照组、阿魏酸钠低、中、高（15 mg/mL、30 mg/mL、60 mg/mL）剂量组，姜黄和莪术不同成分群低、中、高（6 mg/mL、12 mg/mL、24 mg/mL）剂量组。取比浊管，分别加入280μL PPP 后，再分别加入各组对应溶液10μL，作为空白溶液。另取比浊管，各加入280μL PRP，再分别加入各组对应剂量溶液10μL，作为相应的待测溶液。血小板聚集仪预热至37 ℃，以空白溶液调零，后换为对应待测溶液，预热60 s，加入 10μL 腺苷-5′-二磷酸钠盐溶液，测定各组血小板聚集率，计算血小板聚集抑制率[20]，比较姜黄莪术不同成分群抗血小板聚集活性差异。

聚集抑制率＝(对照组血小板聚集率－给药组血小板聚集率)/对照组血小板聚集率×100%

2.4 舒张离体大鼠胸主动脉环试验

颈椎脱臼处死大鼠，快速取出胸主动脉，并置于O2饱和 4°C 的 K-H 液，剔除周围结缔组织，剪去支旁小血管，将血管剪成3～5 mm 的血管环。血管环用两根不锈钢蹬型挂钩水平悬挂于浴管内，一端固定于浴管内，另一端连接张力换能器，调节血管基础张力为1 g，采用离体组织灌流模型和PowerLab 数据分析系统采集和记录离体血管环等距张力的变化。浴槽内含K-H 液，恒温 37°C，持续通 95% O2+CO2，平衡 60 min，每15 min 更换K-H 液。此后，用KCl（60 mmol/L）预收缩血管环，当收缩张力达到坪值后，用预热到37 ℃的K-H 液连续冲洗3 次，每次5 min，待恢复到基础状态后，调节基础张力为1 g，再稳定30 min。当连续的两次收缩幅度小于10%，认为血管环组织结构完整，血管环活性良好，可以开始试验[21]。

经活性检验证明血管环活性良好后，往浴槽内加入KCl（60 mmol/L）预收缩胸主动脉环，血管收缩张力达到坪值时，浴槽内累积加入姜黄莪术各成分群，使其终浓度为 6μg/mL ～500μg/mL，观察和比较不同浓度下姜黄莪术各成分群对KCl（60 mmol/L）预收缩血管环的舒张作用。KCl（60 mmol/L）所致的最大收缩张力为100%，计算各浓度姜黄莪术各成分群所致的舒张百分比，建立姜黄莪术各成分群浓度依赖收缩曲线[22]，比较不同成分群舒张血管环作用差异。

2.5 数据统计

本研究所有数据均采用SPSS 19.0 统计软件和Graphpad prism 5软件进行分析，数据以-x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 姜黄莪术萜类与姜黄素类成分群的分离与确定

姜黄和莪术总浸膏经聚酰胺色谱70%甲醇水洗脱部分，在TLC 检测时，可见光下无显色，后经硫酸乙醇显色又呈粉色或紫红色，结合药材主要化合物类型，初步推测为萜类成分；而100%甲醇洗脱部分在可见光下即为鲜黄色，初步推测为姜黄素类成分。

随后通过UPLC-Q/TOF-MS 检测姜黄70%甲醇水洗脱部分，结果显示（见图1、表2），该部分主峰有7个，其紫外最大吸收波长（λmax）均在200～280 nm，分子量范围大多为200～280，符合萜类化合物的UV和MS特征[23-24]；其中，峰1～6的化合物骨架有15个碳原子，故推测属于萜类中倍半萜类型；峰1、3、4和5的λmax在240 nm附近，这说明其可能为含有α,β不饱和酮的倍半萜类成分[21]，这与此前文献中报道的姜黄和莪术中主要为倍半萜类成分相符。以相同的方法检测了莪术70%甲醇水洗脱部分（见图2、表2），发现此部分主峰有6个，其λmax在200～280 nm，分子量范围在200～280，也符合萜类化合物的UV和MS特征[23-24]，其中4、5号离子峰占比最大，说明其所代表的成分在此部分浸膏中含量最高。

姜黄和莪术100% 甲醇洗脱部分经UPLC-Q/TOF-MS 检测发现，其主要成分λmax在 430 nm 左右，分子量范围为290～400，符合姜黄素类化合物的UV 和MS特征[25-26]（见图3、图4、表3、表4）。

3.2 抗血小板聚集试验结果

试验结果显示（见图5），与空白组比较，姜黄与莪术姜黄素类成分群在低浓度（6 mg/mL）时对血小板聚集的抑制作用尚不明显（P＞0.05），而在中浓度和高浓度时均能一定程度的抑制血小板聚集（P＜0.05），并呈浓度依赖性。同时，姜黄-姜黄素中浓度和高浓度抑制率分别为12.0%±3.68%和22.2%±4.18%，与莪术-姜黄素中浓度抑制率（12.1%±7.31%）和高浓度抑制率（16.3%±5.31%）比较，无显著性差异。而莪术-萜类低浓度对血小板聚集抑制率为16.86%±6.27%，已强于姜黄-萜类高浓度抑制率7.89%±3.89%，差异显著，故就萜类成分群而言，莪术-萜类（P＜0.01）抑制血小板聚集作用明显强于姜黄-萜类（P＞0.05）。上述试验结果表明，姜黄与莪术抗血小板聚集活性差异可能与萜类成分群密切相关。

表1 姜黄-萜类UPLC-Q/TOF-MS检测结果

3.3 舒张离体大鼠胸主动脉环试验结果

活性良好的离体大鼠胸主动脉环血管环于1 g 静息张力平衡后，经KCl 诱导收缩，待张力收缩到达坪值，以累计给药的方式加入姜黄和莪术各成分群（6μg/mL～500μg/mL）处理血管环。试验结果显示（见图6），姜黄-萜类和莪术-萜类均浓度依赖性（6μg/mL～500μg/mL）舒张KCl 预收缩的大鼠胸主动脉血管环。当姜黄-萜类浓度为50μg/mL 时，血环管舒张幅度达50%，EC50为31.2μg/mL；而莪术-萜类浓度为150μg/mL 时，血管环舒张幅度超过50%，EC50为90.8μg/mL。这说明对于KCl 预收缩的离体大鼠胸主动脉血管环，姜黄-萜类对其舒张作用稍强于莪术-萜类。而姜黄和莪术中的姜黄素类成分群浓度在500μg/mL 对离体大鼠胸主动脉血管环均无明显舒张作用。上述试验结果表明，姜黄和莪术中萜类成分群可能是两者发挥舒张胸主动脉环（KCl 预收缩）作用的主要活性成分群，且两者在舒张作用上的差异与其所含萜类成分密切相关。

图2 莪术-萜类总离子流图

表2 莪术-萜类UPLC-Q/TOF-MS检测结果

图3 姜黄-姜黄素总离子流图

表3 姜黄-姜黄素UPLC-Q/TOF-MS检测结果

图4 莪术-姜黄素总离子流图

表4 莪术-姜黄素UPLC-Q/TOF-MS检测结果

图5 姜黄与莪术各成分群对ADP诱导的血小板聚集影响（，n=6）

图6 姜黄与莪术各成分群对KCl预收缩血管环张力影响（，n=6）

4 讨论

姜黄和莪术为同属异种活血化瘀药，临床上广泛用于治疗痛经、经闭、胸痹心痛等血瘀证候，但两者传统活血功效有所差异，姜黄归为“活血”类药物，莪术则归为“破血”类药物，二者活血能力不同，而造成这一差异的物质基础尚不明确。本实验以此为出发点，通过聚酰胺柱色谱并结合UPLC-Q/TOF-MS 分析技术分离并确定了姜黄和莪术的萜类成分群和姜黄素类成分群，随后采用抗血小板聚集、离体大鼠胸主动脉环试验对姜黄和莪术的姜黄素类成分群和萜类成分群的抗血小板聚集和舒张血管活性进行了比较研究，实验结果表明，两者姜黄素类成分群活性无明显差异，但萜类成分群差异显著。莪术-萜类能明显抑制血小板聚集（P＜0.01），而姜黄萜类无明显作用（P＞0.05）；姜黄和莪术萜类成分群虽均能在一定程度上舒张KCl预收的血管环，但姜黄-萜类的舒张作用（EC50=31.2μg/mL）强于莪术-萜类（EC50=90.8μg/mL）。由此可见，姜黄莪术中萜类成分群为其主要活性成分群，且两者活血功效差异与其萜类成分密切相关。

上述研究初步表明，姜黄与莪术的药理作用在活血化瘀方面有诸多相似之处，但又存在一定差异，提示两者在临床运用上需根据证候特点，区别使用。虽然以抗血小板聚集试验和舒张离体大鼠血管环试验来反应两者传统活血功效差异，不是非常全面，但该研究从一定程度上揭示了两者在临床上的区别使用与物质基础密切相关，这为姜黄与莪术进一步的开发利用提供了方向和依据。本课题组接下来的研究将对姜黄和莪术萜类成分群进行进一步分离、纯化、鉴定，从中得到单体成分，以单体成分验证姜黄与莪术的活血功效差异。