冬虫夏草产地土壤中耐砷细菌的分离、鉴定及耐砷能力测定＊

杨 俐 ，邓阳川 ，苏燕燕 ，叶 萌 ，向 丽 ＊＊

（1. 中国中医科学院中药研究所 中药鉴定与安全性检测评估重点实验室 北京 100700；2. 四川农业大学林学院温江 611130）

砷是自然界中普遍存在的一种类金属元素，是一种有毒、有害物质，具有致癌性[1]。砷在土壤中以无机和有机两种形式存在，主要以离子状态存在，有三价砷As（Ⅲ）与五价砷As（Ⅴ）两种价态，而As（Ⅲ）比As（Ⅴ）毒性高约100倍[2-4]。无机砷在动物、真菌、人体中代谢主要是还原和氧化甲基化，进入细胞内的五价无机砷被还原为三价无机砷，再进行甲基化代谢，形成多种含砷化合物，砷在体内的代谢产物是导致机体发生砷中毒的主要因素[5-8]。虽然砷对人体具有很大的毒性，但在长期的历史演化过程中，一些微生物进化出了各种砷代谢机制，能够抵抗高浓度的砷，甚至还能利用砷作为能源[9-11]。微生物的砷代谢机制主要有As（Ⅲ）化能有机异养型和无机自养型氧化、As（Ⅴ）细胞质还原和异化砷还原、As（Ⅲ）甲基化，根据微生物对砷的代谢机制不同将其分为砷氧化微生物、砷还原微生物和砷甲基化微生物[12-14]。砷氧化细菌能将As（Ⅲ）氧化为毒性较弱As（Ⅴ），砷甲基化细菌通常生成毒性较弱的有机砷产物，均能降低环境中砷毒性。砷还原细菌能将As（Ⅴ）还原为毒性更强的As（Ⅲ），As（III）更容易被植物或微生物吸收造成砷富集[5,15]。

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌[Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.] 寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科（Hepialidae）昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，是我国传统名贵中药，冬虫夏草与人参、鹿茸并列为我国“中药三宝”[16-17]。野生冬虫夏草普遍存在着重金属砷含量超标的问题，总砷含量为2.12-15.51 mg·kg-1[18-20]。在前期研究中，野生冬虫夏草子实体转录组数据库内含有29 条与砷氧化细菌（Herminiimonas arsenicoxydans）染色体相似度较高的序列，其中25条的序列相似性为100%。但是在无菌条件下人工繁育的24批冬虫夏草总砷含量为0.3-0.4 mg·kg-1[21]，远低于《中华人民共和国药典》、《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》、《GB 2762-2012 食品安全国家标准食品中污染物限量》等几个标准的最低限，在安全范围内。冬虫夏草分布的青藏高原地区土壤砷背景值较高，提供了砷源[22-23]，因此，推测土壤中的耐砷细菌和冬虫夏草自身对砷的代谢是导致冬虫夏草药材砷超富集的主要原因。

本研究拟对冬虫夏草五个主要产地土壤中的耐砷细菌进行分离、鉴定，筛选出一批耐砷细菌，探究菌株的氧化还原性和耐砷能力，为后续进行冬虫夏草砷超富集机制研究奠定基础。

1 材料

1.1 土壤样品采集

在四川省阿坝藏族羌族自治州小金县（石槽沟、边槽沟），四川省甘孜藏族自治州康定市（雅家埂、汪家沟），西藏那曲市比如县等共5个冬虫夏草生长地采集土壤。采样器在土壤表层3 cm 处用多点混样的方法得到，放入封口袋密封。所有样品做好标签并于4 ℃冰箱储存备用。

1.2 试剂及仪器

本研究的试剂及仪器包括：细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技北京有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Fatty Acid Methyl Esters 购 自 Microbial ID 公 司 ；PCR 扩 增 仪 ：Eppendorf Mastercycler X50；气相色谱仪：安捷伦（Agilent）6890N；超净工作台：北京昌平长城净化设备有限公司；恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；API 20NE 购自 Bio merieux 公司；UV-2102 C 型紫外可见分光光度计：龙尼柯（上海）仪器有限公司。

2 方法

2.1 菌株分离纯化

在CDM 培养基（1 L 体系：硫酸铵2.0 g；无水乙酸钠2.0 g；酵母提取物0.5 g；胰蛋白胨1.0 g；葡萄糖0.2 g；固体培养基再加琼脂粉15 g；pH=7.5±0.2）中分别加入砷酸钠（As5+：10 mM）和亚砷酸钠（As3+：2 mM），配成10 mmol·L-1砷酸钠 CDM 培养基和 2 mmol·L-1亚砷酸钠CDM 培养基。取土壤样本1.0 g，分别加入上述液体培养基中，28℃，150 r·min-1培养 2-3 d 后，转接 2 次。将第三次转接的富集液按不同浓度梯度稀释，涂布于含有相同浓度砷的对应固体培养基上，待1-2 d 长出菌落后，经过多次的平板划线分离，得到多个菌的纯培养，编号并保存菌种。

2.2 耐砷细菌的鉴定

2.2.1 形态及生理生化特征分析

从分离纯化的11个菌株中，选择两个生长状态较好的菌株进行形态及生理生化特征分析。将纯化后的单一菌落培养48 h，记录菌落形状、颜色、大小、透明度、黏稠度、边缘是否光滑以及表面是否有褶皱等特点，挑取菌落并将其稀释、涂片、革兰氏染色，在显微镜下观察菌落的形态及染色结果，进而对菌株进行初步鉴定。通过微生物脂肪酸快速鉴定系统（MIDI）和非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定系统（API 20NE）分析菌株生理生化特性。

2.2.2 菌株16S rRNA序列鉴定

28 ℃条件下，菌株在CDM 液体培养基中摇床培养至对数期，离心收集菌体，利用DNA 提取试剂盒提取目的菌株的基因组DNA，用细菌16S 基因通用27F（5ʹ-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3ʹ）和 1492R（5ʹ-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3ʹ）引物，PCR 体系20μL：2×Mix 10 μL，ddH2O 7μL，Primer-F 1μL，Primer-R 1μL，菌液 1μL；PCR 扩增程序：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 1min，38个循环；72℃ 10min；4℃，保存。反应结束后，取5 μL PCR 扩增产物上样于1.5%琼脂糖凝胶，120 V 电压，200mA 电流，电泳25 min，检测扩增效果。PCR 产物送北京擎科有限公司测序。测序结果通过在EzBioCloud（http://www.ezbiocloud.net/eztaxon）公共数据库与已知模式菌进行比较。利用软件MEGA 6.0 按邻接方法（Neighbor-Joining，N-J）构建系统发育树。

2.3 定性硝酸银（AgNO3）染色实验

本研究采用定性硝酸银筛选法[24]，用浓度为1 mmol·L-1的 AgNO3溶液对菌株进行染色，利用 AgNO3与As(Ⅲ)和As(Ⅴ)发生颜色反应的原理，鉴定所得到的菌株是砷氧化或还原细菌。将菌株分别接种于As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的 CDM 培养液中培养，对照组接种大肠杆菌，培养24h 后向培养液中滴加AgNO3溶液，观察菌液颜色变化，每个处理重复三次。

2.4 砷耐受能力的测定

以相同接种量将菌株分别置于含亚砷酸钠、砷酸钠的CDM 培养液中培养，As (Ⅲ)浓度分别为8 mmol·L-1、12 mmol·L-1、16 mmol·L-1、20 mmol·L-1，As (Ⅴ)浓 度 分 别 为 20 mmol·L-1、35 mmol·L-1、40 mmol·L-1、70 mmol·L-1，28℃，150 r·min-1培养 24 h，用紫外可见光分光度计在600 nm 处测吸光度值OD 600，以砷浓度（mmol·L-1）为横坐标，以吸光度值OD 600 为纵坐标，绘制菌株耐砷浓度图，每个处理重复三次。

3 结果与分析

3.1 菌株分离

从5 个主产地中分离得到11 株菌株，其中砷酸钠（As5+：10 mM）处理中共分离到5 株菌，亚砷酸钠（As3+：2 mM）处理中共分离到6 株菌。采用16S rRNA进行初步鉴定后，11 个菌株主要属于不动杆菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus），其中不动杆菌属占大多数。砷酸钠（As5+：10 mM）处理的产地中分离的菌株是不动杆菌属、芽孢杆菌属，亚砷酸钠（As3+：2 mM）处理的产地中主要分离到不动杆菌属。从四川省小金县和西藏那曲中各挑取一株优势菌株，分别编号为XB和XNQ用于后续鉴定分析。

3.2 菌株鉴定

3.2.1 菌落形态特征

菌株XB 革兰染色为阴性、杆状，常单个、成对或成团存在，需氧。30℃培养24 h后菌落成米黄色，直径为1 mm 左右，圆形，表面光滑，凸起。菌株XNQ 革兰染色为阴性、杆状，常单个、成对或成团存在，需氧。30℃培养24 h 后菌落成米黄色，直径为1.5 mm 左右，圆形，表面光滑，凸起。因此，菌株XB 和XNQ 均为革兰氏阴性菌，菌株XNQ单个菌落直径较XB大，其他形态特征相同。菌株形态及革兰氏染色见图1。

3.2.2 生理生化特征

菌株XB 和XNQ 的主要脂肪酸类型相同，均为C18:1 ω9c、C16:0、Summed Feature 3 (C16:1 ω7c/C16:1 ω6c)和C12:0，菌株XB 主要脂肪酸含量分别为31.34 %、23.76 %、23.69 %、6.04 %，菌株XNQ 主要脂肪酸含量分别为40.03%、21.68%、16.06%和4.63%。API 20NE 检测显示，菌株XB 阳性反应有：阿拉伯糖、己二酸、苹果酸、柠檬酸和苯乙酸，阴性反应有：硝酸钾、色氨酸、葡萄糖、精氨酸、尿素、七叶灵、明胶、对硝基-D-甲基半乳糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐和癸酸。菌株XNQ 阳性反应有：阿拉伯糖、癸酸、己二酸、苹果酸、柠檬酸和苯乙酸，阴性反应有：硝酸钾、色氨酸、葡萄糖、精氨酸、尿素、七叶灵、明胶、对硝基-D-甲基半乳糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖和葡萄糖酸盐。主要差异在于菌株XNQ能利用癸酸，而XB不能利用癸酸。见表1。

图1 菌株的形态及革兰氏染色图

表1 菌株XB和XNQ的脂肪酸组成

续表

3.2.3 16S rRNA基因的序列分析

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，2 株细菌均可扩增出约1400 bp 单一、清晰的序列条带，扩增效果较好。双向测序结果运用CodonCode Aligner V 7.0.1（CodonCode Co.,USA）进行测序峰图的校对拼接。获得的基因片段在EzBioCloud（http://www.ezbiocloud.net/eztaxon）公共数据库中与已知模式菌进行比较。结果如表 2 所示，菌株 XB 获得 16S 片段长 1431 bp，与已知种Acinetobacter guillouiae的序列 APOS01000028 相似性为99.72%，相差四个碱基。菌株XNQ 获得的16S片段长1431 bp，与已知种Acinetobacter nosocomialis的序列APOP01000014 相似性为99.86%，相差两个碱基。通过Mega 6.0 构建系统发育树（见图2），菌株XB 与A.guillouiae聚为一类，菌株XNQ与A.nosocomialis聚为一类。结合菌株形态特征、生理生化特性及16S rRNA序列来看，XB为A.guillouiae，XNQ为A.nosocomialis。

表2 菌株XB和XNQ的16 S序列比较分析结果

图2 菌株XB、XNQ系统发育树

3.3 菌株氧化还原性

AgNO3溶液与As（Ⅲ）反应生成浅黄色沉淀，与As（Ⅴ）反应生成浅棕色沉淀[24]。菌株培养24h 后，加入AgNO3溶液，菌株 XB 和 XNQ 的颜色变化如图 3 所示。CK 组As（Ⅲ）培养液呈浅黄色，As（Ⅴ）培养液呈浅棕色，静置一段时间后，离心管底部会析出对应颜色的沉淀。XNQ、XB 菌液在As（Ⅲ）培养液中显黄色，说明培养液中仍然是As（Ⅲ），菌株不具有砷氧化性。XNQ、XB 菌液在 As（Ⅴ）培养液中也显黄色，可知XNQ、XB 菌株将As（Ⅴ）还原成As（Ⅲ），具有砷还原性，均是As（Ⅴ）还原细菌。

3.4 砷耐受能力测定结果

接种后测定菌液初始OD 600 约为0.05，随着As（Ⅲ）、As（Ⅴ）浓度升高，菌株的OD 600越来越小，砷对菌株的抑制作用越大（见图4）。随着砷浓度的增加，菌株的生长繁殖速率下降。两种菌对As（Ⅲ）的耐受性相同，当As（Ⅲ）的浓度达到20 mmol·L-1时，菌株不再生长，对As（Ⅴ）耐受性也相同，当As（Ⅴ）浓度达到70 mmol·L-1，菌株不再生长。菌株对 As(Ⅴ)的耐受性略高于As（Ⅲ），这可能是由于XB 和XNQ 都是As（Ⅴ）还原细菌，且As（Ⅲ）毒性远远大于As（Ⅴ）。无论是As（Ⅲ）还是As（Ⅴ）培养液中，当砷离子浓度相同时，培养液中菌株XB 的细菌数量多于菌株XNQ，说明XB菌株对砷的耐受性略强于XNQ菌株。

4 讨论

从冬虫夏草五个主要产地土壤中分离纯化了一批耐砷细菌，共筛选出11 株菌株，分属不动杆菌属和芽孢杆菌属两个属，相比其他研究者从其他环境中分离出的耐砷菌株的种类较少，可能是产地地理环境差异造成的[25]。对四川省小金县石槽沟和西藏那曲市比如县的两株菌进行了形态、生理生化、16S rRNA 分析，鉴定结果分别为不动杆菌属A. guillouiae和A.nosocomialis。已有研究发现，A.guillouiae能降解苯酚，能抑制铜绿微囊藻的生长，降低微囊藻素合成，能耐受高浓度NaCl 和多种重金属离子[26-28]，A.nosocomialis是近年来最常出现的可引起严重人类疾病的医院获得感染条件致病菌[29]，但有关两种菌对重金属砷的耐受性的研究较缺乏。

图3 硝酸银（AgNO3）溶液染色结果

图4 菌株对砷的耐受性

本研究得到两种菌株对As（Ⅲ）、As（Ⅴ）的耐受性相 同 ，分别为 20 mmol·L-1、70 mmol·L-1。 Vivian Hsiu-Chuan Liao 等[30]从高砷污染水中分离10种兼性厌氧砷酸盐还原菌，对As（Ⅴ）耐受性最高达到800 mmol·L-1，Sangeeta Shakya 等[31]发现史密斯芽孢杆菌（Bacillus smithii）能耐 1000 mg·L-1的砷酸盐和 749 mg·L-1的亚砷酸盐，吴丹等[32]发现假单胞菌属、苍白杆菌属、芽孢杆菌属、威廉氏菌属和节细菌属中的6 株细菌对As（Ⅴ）和 As（Ⅲ）的耐受性值分别高达 800 mmol·L-1和 20 mmol·L-1。由此可见，相对于已发现的其他菌株，研究分离的A.guillouiae和A.nosocomialis的耐砷能力不是特别高，但对As（Ⅴ）和As（Ⅲ）的耐受能力均表现出相同的趋势，即对As（Ⅴ）的耐受能力高于As（Ⅲ）。

细菌在对高砷环境长期的适宜中，进化出砷转化机制以抵抗不利环境，一般有As（Ⅲ）的氧化、As（Ⅴ）的还原、砷的甲基化三种[33]。已有研究表明，一些土壤中的耐砷细菌可以通过砷转化机制促进植物生长，同时使植物体内砷含量增加[34-35]。本研究发现的两种菌都是As（Ⅴ）还原细菌，能将As（V）还原为毒性更强的As（III），然后利用亚砷酸盐特异性转运蛋白arsB 将As（III）排出体外，从而降低细胞内毒性[36]。研究发现，砷在冬虫夏草中主要以无毒的有机砷形式存在；有毒的无机砷仅占8.69%，且主要集中在虫体中，多以亚砷酸盐、砷酸盐形式存在；子座中As（V）含量大于As（III），虫体中As（III）大于As（V）[19,37]。金鹏飞等[38]发现，冬虫夏草对砷是具有一定的甲基化代谢功能的。根据实验结果可以推测，耐砷细菌对冬虫夏草砷富集可能有一定的促进作用，砷还原细菌将土壤中As（V）还原为As（III），能促进冬虫夏草对As（III）的吸收，冬虫夏草菌通过对As（III）进行甲基化，将As（III）转化为甲基胂酸，并进一步代谢为各种含砷化合物，导致冬虫夏草内砷含量增加。

因此，在未来有必要深入研究耐砷细菌、冬虫夏草自身砷代谢途径与冬虫夏草砷富集之间的关系，通过实验数据解释冬虫夏草砷超富集机制。土壤中细菌种类繁多，本研究从冬虫夏草产地土壤中筛选出的耐砷细菌种类较单一，仅对其中两株作了详细鉴定分析，均为砷还原细菌，后续还需对其他的菌株进一步进行鉴定分析，测定氧化还原性，为研究耐砷细菌对冬虫夏草砷超富集机制试验提供科学依据。