清燥救肺汤对荷Lewis小鼠肺癌细胞中ACO1与ACL和FFA及CHO的影响＊

胡 桥，余 功，饶 斌，谢 斌

（江西中医药大学中医学院 南昌 330004）

肺癌常有干咳少痰、痰中带血、声音嘶哑等燥热伤肺表现，西医放化疗虽能明显抑制肺癌细胞增殖，但其燥热症状仍然存在，严重影响肺癌患者的生活质量[1]。因此，抑制肺癌细胞增殖同时缓解燥热是临床治疗肺癌急需解决的问题。中医学认为，肺为娇脏，喜润恶燥，易受外界燥邪入侵致病，燥热伤肺是肺癌的重要病机[2]。清燥救肺汤甘凉滋润，清金保肺，实为清热润燥良方，凡病机属燥热伤肺、气阴两伤，临床表现为一派津亏燥热症状，均可遵照“燥者濡之”的原则应用本方加减进行治疗。故清燥救肺汤常用于肺癌临床应用，疗效显著，为诸多医家所推崇[3-6]。

肿瘤细胞的增殖需要大量能量及合成原料，因此抑制细胞的能量生成，减少中间代谢产物合成，可有效抑制肿瘤细胞增殖。顺乌头酸酶（ACO1）及三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶(ACL)是三羧酸循环的两个关键酶，抑制其表达可降低肿瘤细胞能量代谢速率，减少游离脂肪酸（FFA）及胆固醇（CHO）肿瘤细胞合成原材料，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用[7-8]。

本课题组前期研究中发现清燥救肺汤能显著抑制荷Lewis 小鼠肺癌细胞增殖，抑制肿瘤细胞糖酵解关键限速酶活性，降低葡萄糖的摄取率，减少乳酸形成，从而导致进入三羧酸途径的乳酸明显减少。故本研究在前期研究的基础上，拟建立荷Lewis 肺癌小鼠模型，从三羧酸循环能量代谢角度进一步探索清燥救肺汤抗肺癌的机制，以期为临床提供参考。

1 材料

1.1 药物

清燥救肺汤组成：生石膏12 g，阿胶9 g，霜桑叶9 g，枇杷叶9 g，炙甘草3 g，麦冬10 g，党参12 g，苦杏仁9 g，于北京同仁堂药店购买。将中药放入10 倍清水中浸泡0.5 h 后煎煮1 h，药液沸腾后再改用文火继续煎煮40 min，然后用三层纱布进行过滤，确保过滤干净；留下的药渣继续加入8 倍量的清水进行第二次煎煮，同理煮沸后改用文火煎煮40 min，继续用三层纱布过滤，将两次滤液混合在一起，置于60℃恒温烘箱内烘干后用打粉机研磨成干粉27.62 g（1 g 含0.28 g 杂质），故干粉实际有效成分质量为27.62×0.72=19.9 g，得率19.9 g/73 g=27.26%。密封干粉，4 ℃保存备用。药量计算方法参考《中药药理研究方法学》[9]，小鼠用药剂量=标准体质量×人的剂量，将小鼠中剂量代替人临床剂量。经前期预实验研究探索，本研究将清燥救肺汤高、中、低剂量分别定为11，5.5，2.75 g·kg-1·d-1。阳性药物采用环磷酰胺（CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字16092525）进行腹腔注射，每次给药剂量 25 mg·kg-1·d-1，隔日进行1次。

1.2 动物和瘤株

黑色雄性小鼠(SPF 级C57BL/6J) 50 只，单只质量（20±2）g，于苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司购入，合格证号NO.201709571。小鼠Lewis 原代肺癌细胞（编号36470TM），从ATCC 细胞库购入，批号JZLLSC:2017-0030。

1.3 试剂

RIPA 细胞裂解液（北京普利莱基因技术有限公司，批号C1053）；十二烷基硫酸钠（SDS）（西陇科学股份有限公司，批号151-21-3）；BCA 蛋白定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit）（北京康为世纪生物科技有限公司，批号CW0014S)；封闭专用脱脂奶粉（北京普利莱基因技术有限公司，批号P1622）；PCR mix(美国MCE 公司，批号HY-K0501)；CHO、FFA 酶链免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，批号分别为JL18914，JL11286）。

1.4 仪器

CO2-IR 型CO2细胞培养箱（上海丙林电子科技有限公司），Neofuge 13R型高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司），TC-100B 型恒温摇床（上海领成生物科技有限公司），92-14860-00 型凝胶成像系统（美国 Alpha Innotech 公司），XW-80A 型 LongGeneRNA 逆转录仪（上海青浦沪西仪器厂），AFD9600 型荧光定量PCR仪（杭州安杰思有限公司）。

2 方法

2.1 Lewis细胞的培养及造模方法

将Lewis 细胞从液氮罐中拿出快速复苏，然后在培养瓶中加入3 ml 10%FBS 的DMEM 培养基，将培养瓶放于含5% CO237 ℃的恒温培养箱中进行贴壁培养。取生长状态良好Lewis 细胞用生理盐水将其密度调 至 5×106个/mL，再 以 0.2 mL/只 接 种 于 小 鼠 右腋下[10]。

2.2 分组及给药

将小鼠随机分为5 个小组，每组10 只，5 个小组分别是模型组，CTX 组，清燥救肺汤高、中、低剂量组。以接种后开始计算，24 h后，模型组用生理盐水进行灌胃，0.2 mL/只，每 12 h 给药 1 次；CTX 组用环磷酰胺进行腹腔注射，按50 mg·kg-1剂量给药，隔日一次；清燥救肺汤高、中、低剂量组则在造模前2周即开始进行灌胃给药，高、中、低剂量分别按照11，5.5，2.75 g·kg-1·d-1给药，每12 h给药1次，接种后继续给药2周。

2.3 实时荧光定量PCR检测ACL mRNA表达水平

取冰冻肿瘤组织50 mg 于研钵中，往研钵里倒入适量的液氮用研锤进行充分研磨，然后往研钵中加入trizol 1 mL，静置 5 min 后于 4 ℃，12 000 r·min-1离心 10 min，离心后取出静置5 min，加入氯仿0.2 mL，剧烈震荡30 s，静置3 min，以4 ℃，12 000 r·min-1 第二次离心10 min；吸取上层水相至另一离心管中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后以 4 ℃，12 000 r·min-1离心 10 min，弃上清，留沉淀；75%乙醇对沉淀进行洗涤；再以4 ℃，12 000 r·min-1离心 2 min，弃上清，留 RNA 沉淀；放置2～3 min，晾干后加入无酶水30～100 μL 溶解，充分溶解提取总RNA，逆转录为cDNA。再以cDNA为模板，以β-肌动蛋白(β-actin)基因为内参，采用两步法PCR 反应程序，扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s；61 ℃退火10 s；72 ℃延伸1 min；共40个循环。反应结束后记录相应Ct值和溶解曲线，所有样品均重复检3 次。以2-△△Ct法对目的基因进行相对定量分析。引物通过引物设计软件oligo6 自行设计，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测ACO1 蛋白表达

取肿瘤组织0.1 g，充分剪碎放入EP 管中加入钢珠和RIPA 裂解液，将EP 管放入组织匀浆机中充分裂解 30 min；4℃，12 000 r·min-1离心 15 min，提取其总蛋白上清液，用BCA 法按说明书测定蛋白浓度。以GAPDH 为上样内参对照。将各组蛋白调至等浓度后进行SDS-PAGE 电泳，转到PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭，TBST 洗膜3 次，加入一抗（1：6 000），4℃孵育过夜；洗膜，加二抗（1：6 000），显影，曝光。采用Alpha view SA 图像分析软件分析蛋白条带灰度值。

2.5 ELISA检测FFA、CHO的含量

取肿瘤组织上清液，按ELISA 试剂盒说明书进行标准操作。然后将反应好的96 孔板放入酶标仪中以450 nm 波长测定各孔的A，最后依据标准孔A绘制出标准曲线，按曲线方程计算各样品浓度值。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 清燥救肺汤对荷Lewis 小鼠肺癌细胞ACO1 蛋白含量及ACL mRNA表达的影响

图1 荷Lewis小鼠肺癌组织ACO1蛋白表达电泳

与模型组比较，CTX 组及清燥救肺汤高、中、低剂量组ACO1 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）；与CTX组比较，清燥救肺汤高、中、低剂量组ACO1 蛋白表达升高（P＜0.01）；与清燥救肺汤高剂量组相比，中、低剂量组 ACO1 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）；与清燥救肺汤中剂量组相比，低剂量组ACO1 蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，CTX 组及清燥救肺汤高、中、低剂量组肺癌细胞中ACL mRNA 表达降低(P＜0.01)；与CTX 组相比，清燥救肺汤高、中、低剂量组中ACL mRNA 表达升高（P＜0.01）；与清燥救肺汤高剂量组相比，清燥救肺汤中、低剂量组ACL mRNA 表达升高（P＜0.01）；与中剂量组相比，低剂量组中 ACL mRNA 表达升高（P＜0.01），见表 2及图1。

3.2 清燥救肺汤对荷Lewis 小鼠肺癌细胞CHO 浓度及FFA浓度的影响

与模型组比较，CTX 组及清燥救肺汤高、中、低剂量组CHO 浓度降低（P＜0.01）；与CTX 组相比，清燥救肺汤高、中、低剂量组中CHO 浓度升高（P＜0.05，P＜0.01）；与清燥救肺汤高剂量组比较，中、低剂量组CHO 浓度升高（P＜0.05，P＜0.01）；与中剂量组比较，低剂量组CHO 浓度升高（P＜0.05）。与模型组比较，清燥救肺汤高、中、低剂量组及化疗组FFA 浓度降低（P＜0.01）；与CTX 组相比，清燥救肺汤高、中、低剂量组中FFA 浓度升高（P＜0.01）；与清燥救肺汤高剂量组比较，中、低剂量组FFA 浓度升高（P＜0.01）；与中剂量组比较，低剂量组FFA 浓度升高（P＜0.01），见表3。

表2 清燥救肺汤对荷Lewis小鼠肺癌细胞ACL mRNA表达及ACO1蛋白的影响(,n=5)

表2 清燥救肺汤对荷Lewis小鼠肺癌细胞ACL mRNA表达及ACO1蛋白的影响(,n=5)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与CTX组比较##P＜0.01；与高剂量组比较●P＜0.05，●●P＜0.01；与中剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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表3 清燥救肺汤对荷Lewis小鼠肺癌细胞CHO浓度及FFA浓度的影响(,n=5)

表3 清燥救肺汤对荷Lewis小鼠肺癌细胞CHO浓度及FFA浓度的影响(,n=5)

注：化疗组为隔日给药；与模型组比较，**P＜0.01；与CTX 组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与高剂量组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01；与中剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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4 讨论

肿瘤细胞不同于正常细胞，其以更频繁的分裂增殖为特征，其代谢必然会发生重大改变。三羧酸循环作为人体糖、脂、蛋白质代谢的关键途径和最终通路，该循环过程中产生柠檬酸、游离脂肪酸、胆固醇等多种中间代谢产物，进而为肿瘤细胞快速增殖提供了大量的原材料[11]。亦有研究[12-13]表明，三羧酸循环的新陈代谢重新编排是肿瘤细胞的重要特点，该循环中的关键激酶如ACL、ACO1 及其代谢产物参与了肿瘤的发生过程。

肿瘤细胞脂肪酸合成增强，导致三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）柠檬酸裂解酶的过量表达及活性升高[14]。ACL 作为脂肪酸合成的调控酶，可在胞质中将柠檬酸分解为草酰乙酸和乙酰辅酶A，乙酰辅酶A 不仅是内源性脂肪酸合成的主要原料，亦是合成胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。因此ACL 是脂质代谢与糖代谢(产能)之间的桥梁，现已发现ACL 在肺癌、胃癌及肝癌等多种肿瘤疾病中表达升高或活化增强[15]。小干扰RNA 或应用药物抑制ACL，能减缓肿瘤细胞的生长并诱导其凋亡。在本实验中，PCR 结果显示清燥救肺汤高、中、低剂量组ACL mRNA 表达均低于模型组，提示清燥救肺汤可能通过抑制ACL mRNA 酶，减少三羧酸循环中间产物，进而抑制肺癌细胞合成。

三羧酸循环通过底物水平磷酸化有效地催化乙酰 辅 酶 A 成 为 CO2，并 同 时 产 生 NADP，NADH2 和ATP。NADP，NADH2 通过氧化磷酸化最终产生ATP，ACO1 又称乌头酸水合酶或柠檬酸(异柠檬酸)裂解酶，是三羧酸循环途径中不可缺少的关键酶，也是NO 和H2O2等活性氧作用的主要靶点[16]，能催化柠檬酸经顺乌头酸最终生成异柠檬酸。研究[17]显示，抑制顺乌头酸酶会影响三羧酸循环效率，同时还能引起线粒体膜电位下降，氧化磷酸化效率的降低，最终造成线粒体的能量合成下降。本实验中Western blot结果显示，清燥救肺汤高、中、低剂量组肺癌细胞ACO1蛋白表达量均低于模型组，表明清燥救肺汤抑制肺癌细胞能量生成，ACO1可能是其效应靶点之一。

脂肪酸是细胞构建膜磷脂的基本原料，肿瘤细胞具有不断增殖的特征，其增殖需大量脂肪酸[18]。因此，脂肪酸的合成增强，是肿瘤细胞代谢改变的另一重要特征。肿瘤细胞可利用从头合成途径产生脂肪酸从而维持自身的增殖与存活[19-20]，通过化学抑制或敲减其生成的关键调节基因可有效减少肿瘤细胞的增长[21]。此外，脂肪酸合成通路的活化也与肿瘤患者无病生存期缩短及预后不良密切相关。流行病学研究[22]显示，在肺癌、结肠癌、肾癌和乳腺癌等多种肿瘤组织中，FFA 表达及活性增加，与肿瘤的发生发展及预后密切相关。胆固醇是构成细胞膜的重要成分，脂质双分子中脂筏结构是其关键组成部分。恶性肿瘤细胞增殖时，胆固醇摄取增多、合成加速。Sok 等[23]研究表明胆固醇水平＜5.3 mmol/L 的患者总生存率显著低于高胆固醇组患者，提示非小细胞肺癌患者术前总胆固醇水平与术后预后有关。亦有研究[24]发现，细胞膜上的胆固醇增加能诱导脂筏聚集，吸引表皮生长因子受体（EGFR）及Ras 等蛋白到脂筏中，这些蛋白受刺激后被激活，通过信号传导，从而促进肿瘤发生。本实验中ELISA 结果提示，清燥救肺汤高、中、低剂量组肺癌细胞中胆固醇及脂肪酸表达量低于模型组，表明清燥救肺汤能抑制肺癌细胞增殖可能是通过减少肿瘤细胞合成原材料，抑制其脂质合成。

中医药在肺癌综合治疗模式中占有越来越重要的地位，其在促进患者术后恢复，减轻放化疗副作用、有效延长患者生存期方面具有独特优势。清燥救肺汤主治燥热伤肺，气阴两伤证，与肺癌燥热病证十分相符，实验与临床研究均证实清燥救肺汤具有良好的抗肺癌效果。本研究结果表明，清燥救肺汤能有效抑制荷Lewis 肺癌细胞能量代谢，减少相关代谢产物生成，其机制可能与下调ACL mRAN 及ACO1的表达，并降低癌细胞中FFA、CHO 含量有关，但该方对上述调控机制仍需进一步深入的研究。