凤尾草总黄酮对肺癌细胞迁移抑制作用及机制的研究＊

曲 杰，郭 静，褚会松，吕喜英＊＊

（1. 承德医学院附属医院 承德 067000；2. 承德医学院附属医院 承德 067000）

凤尾草又被称为井口草、凤凰草、山鸡尾、双凤尾等，属凤尾蕨科植物，因其经常在潮湿的地方生长而得名，如石隙、井边和墙根等处[1]。凤尾草生长区域较为广泛，全国大部分地区均可采集到，主要集中在两广地区、福建、江苏、贵州等地区，一年四季均能采集。凤尾草是一种功效丰富，历史悠久的中草药，最早在唐朝《本草拾遗》中有记载，后于明代《中草药性备要》中也曾描述其止血消毒的作用。不同的历史时期均有书籍对凤尾草的疗效进行了记载，如《植物名实图考》《分类草药性》《本草推陈》和《广西本草选编》等。直至新中国初期，凤尾草在我国民间开始逐渐被广泛使用。

随着对凤尾草的化学成分和治疗效果的不断研究，凤尾草在临床上的应用也较为常见，在抗炎消肿、抑制细胞氧化、影响体内某些激素表达等方面均能发挥作用，甚至能起到抗肿瘤作用，另外其排毒消炎、散热止血之功效不容小觑[2]。因此，凤尾草治疗较为广泛，不但对呼吸消化泌尿系统、妇科炎症、皮肤病、癌症、出血症等疾病起到显著疗效，而且在多种疑难杂症的治疗方面也能起到作用，如小儿惊风夜哭、跌打烫伤、猫狗咬伤、农药中毒、眼花牙痛、神经麻痹等[3]。

目前，国内外对凤尾草的临床研究也逐步发展起来，秦波等[4]研究了凤尾草中的组成物质，从全草中分离出22 种化合物，包括黄酮类、萜类化合物、氨基酸、脂肪酸、挥发油等，其中含量最高的为黄酮类[5]。黄酮类是自然界较为常见的一种有机化合物，广泛存在于植物中，且具有多种生物活性，因此在国内外引起重视，得到广泛研究。黄酮类化合物具有以下几点特性：第一，黄酮类化合物的典型特征为能够清除自由基，对感染性疾病、炎症反应、烧伤烫伤及电离辐射等疾病起到治疗作用[6]。第二，黄酮类化合物对人体内的氧化还原反应起到影响作用，催化电子转移，能作为保护机体的重要还原剂[7]。第三，黄酮类化合物能够对多种生物酶具有抑制作用，如氧化还原酶、磷酸酯酶、蛋白酶、水解酶等[8]。第四，黄酮类化合物能够影响机体内激素水平的表达[9]，影响感官表达，协调神经运动，减轻痛觉神经等[10]。第五，黄酮类化合物能通过与重金属离子结合起到解毒作用[11]，对心血管疾病、过敏反应、呼吸系统疾病、癌症、胃肠道溃疡等多种疾病均能起到显著临床疗效[12]。据相关研究结果报道，凤尾草和其他中草药结合可以有效治疗多种癌症，如消化道和妇科等肿瘤[13]。虽然凤尾草的应用广泛，但是关于其对细胞迁移作用方面的研究很少，因此本研究主要研究了凤尾草总黄酮（TFPM）浓度水平对肺癌A549 细胞体外迁移能力的影响，并探讨其发生机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

细胞株从承德医学院实验室获取人肺癌A549 细胞株。

1.1.2 药物的制备

药物的制备：承德医学院提供凤尾草样品，并将其保存于干燥容器中备用。

1.1.3 主要试剂与主要仪器

主要试剂：胎牛血清（Gibco 产品）、RPMI-1640 培养基（Gibco产品），浓度为0.25%的胰蛋白酶（Gibco产品），FGF4 抗体（Sigma 产品），辣根过氧化物酶标记的二抗（博奥森公司产品）。

主要仪器：DF-20M 离心机（湖南湘仪产品），CO2培养箱（美国NUAIRE 公司），显微镜（德国Leica 公司），生物安全柜（上海力康），培养皿（美国Corning 公司），高压消毒锅（日本雅马拓公司产品），分光光度计（HP Agilent），EL104电子天平（梅特勒-托利仪器上海有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

在温度37℃、CO2浓度5%的条件下，将A549 细胞置于RPMI-1640 培养基中进行培养并以胰酶消化，通过显微镜观察细胞生长并提取对数生长期A549 细胞株。

1.2.2 制备TFPM溶液

提取储存良好的凤尾草干燥全草200 g 并进行粉碎，准备浓度为70%的乙醇溶液，将二者分别以1:20的比例进行配伍，在60℃的条件下提取2 h，共提取2次[14-15]。将2 次的提取液融合、冻干后得5.0 g 干燥固体。取磷酸盐缓冲溶液（PBS 溶液）500 mL 将其溶解于所得固体中，利用高速离心机以15000 r/min 分离15 min，共进行 3 次。将离心后的上清液用 0.22 μm 过滤器过滤，灭菌，并置于冰箱中，温度设定为4℃进行保存。最终获得溶液采用芦丁作为对照品并以NaNO2-A1(NO)3-NaOH 显色，紫外分光光度法在510 mm 处测得总黄酮含量[16]。以芦丁的形式制备总黄酮含量为10 mg/mL的溶液。

1.2.3 细胞形态学观察

备好的6孔培养板中每孔各接种1 mL 的A549 细胞悬液，并分别在其中加入浓度为10 mg/ mL、5 mg/mL、2.5 mg/ mL、1.25 mg/ mL 的 TFPM 和不含 TFPM的PBS 溶液各100 μL 进行培养，各组进行对照。每24 h观察每孔中肿瘤细胞形态并详细记录。

1.2.4 细胞划痕实验

在6 孔培养板上铺展后，A549 细胞系逐渐生长，在覆盖划痕后，用PBS 溶液洗涤并在无血清培养基中培养。分别在0 h 和24 h 对划痕距离进行测量并记录。

1.2.5 Transwell 实验

取对数生长期的A549 细胞中加入胰酶，RPMI-1640 培养基制备约5×105/mL 个细胞的悬液并进行铺板。RPMI-1640 完全培养基（含15%的小牛血清）置于24 孔培养板中，每孔各 600 μL。将 100 μL 的 A549细胞悬液和10 μL 1%的 BSA 溶液置于Transwell 的上室中，最终以浓度为0.1%的BSA 溶液维持上室内渗透压。各上室中分别加入100 μL 不同浓度的TFPM 和 PBS 溶液，各下室中各分别加入 600 μL 的RPMI-1640 完全培养基，CO2培养箱常规培养，浓度为5%，温度为37℃，时间为24 h。最后，将培养基用90%乙醇固定，消毒棉擦拭上室面和0.1%结晶紫溶液漂染下室面，风干处理好样本后显微镜观察并记录。选取4 个视野（×400）内的细胞算平均值（共进行3 次）。

1.2.6 Westen blot实验

提取细胞数约为5×106个的A549 细胞原液和加入TFPM 后的A549 细胞，并在其中分别加入细胞裂解液300 μL。半小时后，将其转移至1.5 mL EP 管中，并在4℃下以12000 r/min 离心。将离心4 min 后的上清液置于-20℃温度保存。采用BCA 法测定其中蛋白浓度。上样量蛋白含量为40 ng 并进行电泳（80 V 下30 min，120 V 下 90 min）。在 PVDF 膜上用 PBST 溶液（含有5%脱脂奶粉）密封，经过2 h 后加入FGF4 抗体（1：500）和抗β-actin 抗体（1：500），温度保持在4℃的条件下过夜。PBST 液洗15 min 取膜后蛋白，洗过3 遍后，室温下二抗（1：3000）封闭。1 h 后PBST 液再洗10 min，洗过3 遍后取出。用X-光片记录化学发光法检测的所得溶液。

1.2.7 统计学分析

2 结果

2.1 肿瘤细胞形态学变化

实验结果分为两组，实验组为TFPM 处理（以5 mg/mL 和 10 mg/mL 为例）后的细胞，对照组为 PBS 处理后的细胞。以下结果均以此两浓度药物处理组为例，实验均重复3 次，结果较为一致。结果显示，分别在0 h 和24 h 观察肿瘤细胞生长，对照组A549 细胞生长较为均匀，贴壁现象明显，且细胞规则清晰、形态饱满；实验组A549 细胞生长速度明显减慢，细胞明显坏死缩小，细胞生长贴壁不明显，且此现象与TFPM 浓度有关，TFPM 浓度越高，此现象越明显，两者呈正相关关系，见图1。

2.2 划痕实验

两组细胞经过划痕后出现相同的无细胞区，经24 h 后对照组无细胞区内细胞覆盖明显，肿瘤细胞几乎全部迁移至无细胞区；而实验组无细胞区细胞覆盖不明显，仍有无肿瘤细胞迁移区，且5 mg/mL组细胞迁移比 10 mg/mL 组更明显（P＜0.05），见图2。

2.3 Transwell 实验

对照组和5 mg/mL、10 mg/mL TFPM组穿膜细胞数分别为(36.91±4.47)、(18.05±2.04)、(6.35±2.32)，两组差异显著（P＜0.01）。TFPM 的浓度显著影响跨膜细胞的数量，5 mg/mL 组较10 mg/mL 组穿膜细胞数增加（P＜0.01），两者之间存在负相关，见图3。

2.4 Westen blot实验

实验组FGF4 蛋白水平与对照组相比明显减少（P＜0.05），且TFPM 浓度为10 mg/mL 组较5 mg/mL 组减少更明显（P＜0.05），见图 4。

图1 倒置显微镜下细胞形态学变化

图2 划痕实验细胞迁移情况

图3 Transwell实验，HE染色×400倍

图 4 Westen blot 实验

3 讨论

作为常见的肿瘤，肺癌目前已成为癌症致死的首要病因[17]。根据美国国家癌症中心2018 年发布的最新数据[18]，男性肺癌发病率及死亡率均居首位，女性发病率仅次于乳腺癌，位居第二位，但死亡率仍为第一位，发病率和死亡率分别达到57.13/10 万人和45.80/10万人，成为人类生命健康的头号“杀手”。肺癌的可怕之处不仅在于持续升高的发病率和死亡率，而且因其恶性程度较高，患者生活质量和预后大大降低。相关研究数据显示，早期可手术患者手术治疗后5 年生存率为60%左右，而存在转移的晚期患者5 年生存率明显下降，局部转移为27%左右，远处转移仅为5%左右。由于肺癌患者临床症状并不明显，故约三分之二的患者发现较晚，因此总的5 年生存率大约为15%左右[19]。根据病理类型不同，肺癌可分为两种类型：小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC 又可大致分为肺鳞癌（squamous lung cancer）和非鳞非小细胞肺癌（non-squamous non-small cell lung cancer，non-sq NSCLC）。其中SCLC 约20%，属未分化癌，因此具有较强的侵袭性，且转移率较高，仅部分早期患者可手术。其余80%为NSCLC，因病理类型和分期不同，治疗方法也不同，对于晚期患者主要采取多学科的综合治疗，但临床疗效并不理想[20]。近年来，随着肿瘤分子生物学的不断研究发展，晚期肺癌尤其是non-sq NSCLC，在分子靶向治疗和免疫治疗方面取得了重大进展，为临床治疗提供更多选择，延长患者无进展生存 期（progression-free survival，PFS）和 总 生 存 期（overall survival，OS），提高患者生活质量（quality of life，QoL），但总体来说，NSCLC 患者比SCLC 患者预后相对较好，生存期更长[19,21]。

肺癌患者出现转移将严重降低患者的存活时间和存活质量。转移是恶性肿瘤的一种常见生物学现象，其发生过程较为复杂，受许多基因的调控[22]。经国内外学者多年研究表明，肺癌出现转移现象可能与患者体内多种细胞因子表达异常关系密切[23]。细胞因子上有许多能调节细胞增殖、分化及其相互作用的多肽分子，这些多肽分子能产生多种不同类型、不同功能的细胞[24]。值得注意的是，肿瘤细胞也能大量产生部分这类细胞因子，使得肿瘤细胞具有多种调节功能的细胞，如促使肺癌肿瘤细胞迁移的因子成为国内外专家学者研究的重点，本实验中主要针对成纤维生长因子4（FGF4）进行研究。成纤维细胞生长因子（FGF）存在于多种肿瘤细胞膜上，其基因编码多种蛋白，是一个多基因家族[25]，在多种肿瘤细胞表面均可见到其表达，这表明FGF 可能与肿瘤细胞的增殖有关[26]。FGF4 细胞是其中的一种由多种细胞产生的蛋白，Folkman 等[27-28]相关研究结果认为，FGF4 不但能参与机体的炎症反应、促进血管形成和瘢痕愈合，还能通过作用于细胞的接触抑制、游离、变形、穿膜、附着等多个过程从而影响肿瘤细胞的增殖分化和离散迁移[29]。

目前，临床上应用的抗肿瘤药物多为生物制剂或者化学合成的产物，存在较大的毒副作用，且往往达不到预期的临床疗效。我国作为许多天然药物的盛产地，中草药治疗癌症已经被广泛应用。

迄今为止，有许多关于中药抗肿瘤的相关报道，其中包括中草药的特有成分对肿瘤细胞中细胞因子影响的报道[30]。在对肺癌治疗有效的中草药中，凤尾草中总黄酮含量对抗肿瘤作用和对细胞因子的影响进行深入研究。《本草拾遗》中记载，凤尾草具有排毒杀菌、祛热镇痛及抗肿瘤作用，目前应用于多种疾病的治疗。虽然凤尾草中含有多种化学成分，但提纯后TFPM 为最主要成分，其具有多种生物活性。研究发现，TFPM 的作用主要有三方面：第一，抗菌作用：凤尾草中的黄酮类化合物对多种细菌均有很强的抑制作用，如金葡菌、枯草杆菌、黑曲霉菌等，而对大肠杆菌、青霉菌的抑制作用较弱，对黄曲霉菌则没有见到抑制作用[31]。第二，抗肿瘤作用：颜大海等[32]对凤尾草的实验研究结果显示，凤尾草能激活纤溶系统，阻止血小板的聚集，抑制新生毛细血管，进而降低肿瘤所致的高凝状态，抑制肿瘤细胞的粘附迁移能力。王刚等[33]利用小鼠作为动物实验，将肿瘤细胞注射至小鼠体内，测定凤尾草中的提取物对肿瘤细胞的抑制作用及小鼠脾细胞的增殖作用。实验结果为凤尾草提取物能显著抑制小鼠体内肿瘤细胞，促进脾细胞的增殖，且此现象呈剂量依赖性。第三，保肝作用：刘建群等[34]实验结果显示凤尾草提取物可有效降低肝损伤的小鼠体内转氨酶水平。

目前，对于黄酮类化合物的临床研究报道也较为常见。黄酮类化合物作为大自然中的天然产物，在食物中得到广泛应用，不但能作为多功能食品添加剂，如甜味剂、色素、抗氧化剂等，还能作为生物食品应用，起到防氧化抗衰老、抗癌、降脂降压等功效。除在食品领域的广泛应用，黄酮类化合物在医疗和农业方面的应用也很常见，如各种特效药和杀虫剂等。虽然生物黄铜具有多种功效，但人体内却不能正常合成，且体外摄取的生物类黄酮在机体内代谢较快，不能长期储存。生物类黄酮在植物中较常见，人体主要通过各种饮品摄取，如咖啡、饮料、茶、酒水等，但虽然摄取途径很多，但摄取量却远远达不到获益水平。近年来对生物黄酮类的研究得到越来越多的重视，应用也越来越广，但机体如何消化吸收、在体内的代谢过程等机理仍未全面认识，且其在抗肿瘤作用及其作用机制方面的研究并不多见。故本研究将肺癌A549 细胞作为实验对象，初步研究TFPM 与肿瘤细胞生长繁殖及细胞因子FGF4 蛋白表达水平之间的相互关系，了解其抑制细胞迁移发生的可能相关机制。

实验结果显示，TFPM 阻止肺癌A549 细胞迁移作用明显，肿瘤细胞内FGF4 蛋白水平随之减少，且随着TFPM 浓度的增加，这种现象越明显。相关研究显示，肺癌转移可能与细胞内FGF4 蛋白表达水平上升有关[35]，因此，A549 细胞中 FGF4 蛋白减少可能是 TFPM抑制肺癌细胞迁移的作用机制，但该结论还有待进一步研究论证。