酶法联合Plastein反应制备海参肠调味料

姜淼，李欣怡，宋志远，赵前程，李智博

(大连海洋大学 食品科学与工程学院，辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室，辽宁 大连 116023)

海参营养价值丰富，具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点，富含多种微量元素，营养价值极高[1]，并且具有增强免疫力、延缓衰老、抗肿瘤等生物功效[2,3]。在加工海参的同时会产生海参肠和性腺等副产物，研究表明海参肠的蛋白质和脂肪含量高于海参本身[4]，具有与海参相似的营养价值和抗氧化、抗疲劳、增强免疫力、降血糖、降血脂、抗肿瘤等功效[5]。海参肠中的抗氧化活性物质主要包括多肽、多糖、酚类和黄酮类物质等。海参肠、卵在日本被称作海参花，可以加工成调味品、固体饮料等食品。海参肠中的钒元素、硒元素高于海参体壁。钒元素对机体的正常糖代谢有重要作用，硒元素可以调节人体肌肉系统、增强免疫力[6]。海参内脏中含有大量的游离氨基酸，其中鲜味氨基酸Glu和甜味氨基酸Ala、Gly的含量很高，使其具有鲜美的味道。目前，对于海参肠的加工利用研究尚处于初级阶段，国内未见海参肠的产品大规模销售，部分原因是海参肠的腥味较重，限制了产品的应用推广。

研究表明Plastein反应能通过减少游离氨基酸含量、去除水解物的苦味、腥味[7]，改变蛋白质的功能特性。Plastein反应又称塑蛋白反应或类蛋白反应，可以使肽段通过缩合作用、转肽作用将肽的一级结构改变[8]。一般可以理解为Plastein反应是一种水解的逆反应，通过调整水解产物的底物浓度(通常为20%～50%)，也可加入其他原料来源的肽、氨基酸衍生物，使酶解物发生缩合、重组形成新的肽段，从而实现腥味脱除和功能的改变。Plastein反应只添加食品级的酶，不会产生有毒有害物质，因而可以用于海参肠产品的脱腥。

国内对水产品副产物采用酶技术将优质蛋白质充分利用，制成调味料、鱼酱、浓缩蛋白等产品。近年来，随着海洋生物研究的加深，海洋生物的功能性蛋白和特殊活性物质更多地用于功能性食品以及药物开发。本课题主要对海参肠进行酶解脱腥处理，制备调味料基料，为海参副产物精加工和高价值产品的开发进行一定探索。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海参肠：辽宁省大连市棒棰岛有限公司；邻苯二甲醛、茚三酮：上海市阿拉丁工业公司；四硼酸钠：天津市光复科技发展有限公司；十二烷基硫酸钠：天津市光复精细化工研究所；β-疏基乙醇(分析纯)：天津市福晨化学试剂厂；柠檬酸钠、风味蛋白酶(8×106U/g)、碱性蛋白酶(2×106U/g)：天津市诺奥科技发展有限公司；胃蛋白酶(8×106U/g)：北京索莱宝科学技术有限公司；中性蛋白酶(2×106U/g)：青岛吉宝中新国际贸易有限公司；木瓜蛋白酶(8×106U/g)：天津诺奥酶生产力促进有限公司；胰蛋白酶(5×106U/g)：苏州美高美生物科技有限公司。

日立L8900氨基酸分析仪 日本株式会社日立制作所；FD-1型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；GL-21M高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；R501旋转蒸发仪 沈阳凯威尔实验仪器有限公司；DHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵 郑州博科仪器设备有限公司。

1.2 海参肠调味料工艺流程

新鲜的海参肠→清洗、除去杂质→匀浆(一定料液比)→调pH→酶解(一定加酶量及酶解时间)→沸水浴灭酶→离心→浓缩→冻干→得到酶解物→加水溶解(一定底物浓度)→加中性蛋白酶(一定加酶量)→Plastein反应(一定温度、时间)→得到海参肠调味料。

1.3 海参肠的酶解工艺优化

1.3.1 单酶的筛选

本实验以海参肠为酶解原料，采用中性蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解，各酶的反应条件见表1。

表1 5种酶的最适温度及pHTable 1 The optimum temperature and pH value of five enzymes

其中固定料液比1∶8(g/mL)，加酶量2.0%，酶解时间4 h，指标为感官评分。

1.3.2 风味蛋白酶的酶解条件优化

采用风味蛋白酶，以感官评价为指标进行酶解。

控制酶解时间4 h，加酶量0.6%，料液比1∶8，对酶解温度(40，45，50，55，60 ℃)进行单因素筛选。

控制酶解温度50 ℃，加酶量0.6%，料液比1∶8，对酶解时间(2，3，4，5，6 h)进行单因素筛选。

控制酶解时间4 h，酶解温度50 ℃，料液比1∶8，对加酶量(0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%)进行单因素筛选。

控制酶解时间4 h，酶解温度50 ℃，加酶量0.5%，对料液比(1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10)进行单因素筛选。

1.3.3 感官测定

邀请若干名食品专业的研究生进行前期感官评价测试的筛选，最终选取10 名(男性5名，女性5名) 进行培训并组成感官评定小组，每个样品的感官评分数据去掉最高分和最低分后取算术平均值，感官评分表见表2[9]。

表2 感官评价表Table 2 The sensory evaluation table

1.4 Plastein反应脱腥工艺优化

1.4.1 Plastein反应单酶的筛选

以海参肠酶解液为原料，以游离氨基酸减少量和脱腥率为指标，选用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶进行Plastein反应。固定底物浓度30%，加酶量3%，反应时间1 h，其中反应温度与酶种类有关，木瓜蛋白酶选用55 ℃，中性蛋白酶选用50 ℃，碱性蛋白酶选用55 ℃，胃蛋白酶选用37 ℃。

1.4.2 单因素实验

以游离氨基酸的减少量和脱腥率为指标，选取中性蛋白酶进行如下单因素实验。

控制底物浓度为30%，在50 ℃的条件下反应1 h，对加酶量(1%、2%、3%、4%、5%)进行筛选。

根据上组实验结果，控制加酶量为3%，50 ℃条件下反应1 h，对底物浓度(10%、20%、30%、40%、50%)进行筛选。

根据上组实验结果，控制加酶量为3%，底物浓度为20%，在50 ℃下反应，对反应时间(0.5,1,1.5,2,2.5 h)进行筛选。

根据上组实验结果，控制加酶量为3%，底物浓度为20%，反应时间为1 h，对反应温度(30,40,50,60,70 ℃)进行筛选。

1.4.3 响应面实验

应用Box-Benhnken设计3因素3水平的实验方案，选取加酶量、反应时间、反应温度3个因素进行响应面实验，以游离氨基酸的减少量为指标，响应面因素水平设计见表3。

表3 响应面设计因素及水平Table 3 The factors and levels of response surface design

1.4.4 指标的测定

1.4.4.1 Plastein反应后修饰物游离氨基酸的测定

以邻苯二甲醛法为基础(OPA法)，稍作改进。配制浓度分别为0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg/mL的L-亮氨酸溶液。取0.2 mL不同浓度的 L-亮氨酸溶液、4 mL配制好的OPA试剂，混匀后在空气中静置5 min，在波长340 nm下测定吸光度值，依据标准曲线y=1.41145x+0.02649 (R2=0.9998) 进行分析。

将Plastein修饰物进行离心，离心条件为4 ℃，12000 r/min，20 min。取0.2 mL稀释后的上清液，加入4 mL配制好的OPA试剂，混匀，在空气中静置5 min后，在340 nm波长下测定吸光度值。按照下式计算游离氨基酸的减少量。

游离氨基酸的减少量(%)=反应前的游离氨基酸含量-反应后的游离氨基酸含量。

1.4.4.2 Plastein反应后修饰物脱腥率的测定

根据感官评价方法对Plastien反应前的样品和反应后的修饰物进行感官评价，按照下式计算脱腥率。

脱腥率(%)=感官评价分数/10分×100。

1.5 Plastein反应前后游离氨基酸组成

根据国家标准GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》方法[10]，对样品中的游离氨基酸组成进行测定。

样品处理：称取样品0.1 g，经真空浓缩干燥后定容，取2 mL样品进样，用氨基酸分析仪进行分析。

1.6 数据分析

采用Excel软件对实验数据进行处理分析，得到平均值及方差，并用Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 海参肠酶解条件优化

2.1.1 单酶的筛选

风味蛋白酶包含了内切酶和外切酶两种活性，可以较大程度地去除苦味的肽链，将其降解为氨基酸。另一方面，加入风味蛋白酶使风味前体物水解，释放风味物质，可以在一定程度上增强和改善食品风味。加入风味蛋白酶的实验组具有淡淡的海鲜鲜味，且无其他异味。

图1 酶种类对海参肠原料酶解的影响Fig.1 Effect of enzyme types on enzymatic hydrolysis of sea cucumber intestine

由图1可知，加入风味蛋白酶的实验组，感官评价分数优于加入其他4种蛋白酶的实验组。

2.1.2 风味酶酶解单因素实验结果

2.1.2.1 酶解温度的筛选

酶解温度过高或过低时，蛋白酶的活性受到抑制。当酶解温度趋于酶的最适温度时酶解的效率最高。

图2 酶解温度对海参肠原料酶解的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis of sea cucumber intestine

由图 2可知，随着温度升高，风味蛋白酶酶解液的鲜味呈先增高后下降的趋势，当酶解温度为50 ℃时，感官评价的评分最高，因此风味蛋白酶的最适温度为50 ℃。

2.1.2.2 酶解时间的筛选

在酶解过程中，不同酶解阶段降解释放的肽和氨基酸的种类和含量不同，导致最终感官特性出现差异。

图3 酶解时间对海参肠原料酶解的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis of sea cucumber intestine

由图3可知，海参肠酶解液的鲜味强度随着酶解时间的增加呈先增加再降低的趋势。当酶解时间为4 h时，鲜味口感最佳。

2.1.2.3 加酶量的筛选

图4 加酶量对海参肠原料酶解的影响Fig.4 Effect of enzyme additive amount on enzymatic hydrolysis of sea cucumber intestine

由图4可知，底物的水解作用随着酶添加量的增加逐渐增强，释放出更多的呈味氨基酸，酶解液呈现较好的鲜味，但当加酶量超过0.5%时，肽链进一步被水解，释放出具有苦味的小肽，使感官评分下降。因此，当加酶量为0.5%时，感官评价的评分最高。

2.1.2.4 料液比的筛选

溶液中的酶和底物需要适宜的浓度，才能更好地进行酶解反应。料液比在一定范围内，海参肠被适度酶解，呈味氨基酸释放出来，鲜度增加。

图5 料液比对海参肠原料酶解的影响Fig.5 Effect of ratio of material to liquid on enzymatic hydrolysis of sea cucumber intestine

由图5可知，当料液比为1∶8时，感官评价的评分最高，料液比1∶8为最优的料液比。

2.2 Plastein反应脱腥工艺优化

经过上述单因素优化，获得最佳酶解条件为：在风味蛋白酶的作用下，底物浓度为0.5%，料液比为1∶8 (g/mL)，50 ℃条件下酶解4 h，酶解获得的海参肠酶解液还有一定的腥味，故进一步用Plastein反应进行脱腥处理，制备海参肠酶解液。

2.2.1 单酶的筛选

图6 酶种类对游离氨基酸减少量和脱腥率的影响Fig.6 Effect of enzyme types on the reduction amount and deodorization rate of free amino acids

由图6可知，经中性蛋白酶催化的Plastein反应，其游离氨基酸减少量较为明显，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的脱腥率效果略好于其他两种酶的脱腥效果。在木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的作用下，将更多的苦味肽缩合、重组，改善了修饰物的风味，提高了修饰物的鲜度。综合考虑两种指标，选用中性蛋白酶作为后续Plastein反应用酶。

2.2.2 Plastein反应单因素实验结果

2.2.2.1 加酶量单因素筛选

游离氨基酸减少量和脱腥率都随加酶量的增加呈先升高后下降的趋势，游离氨基酸减少量增加，说明更多具有腥苦味道的游离氨基酸结合到肽段中，从而改善了产品的味道。综上，当游离氨基酸减少量和脱腥率呈现相同的趋势时说明Plastein反应脱腥效果较好。

图7 加酶量对游离氨基酸减少量和脱腥率的影响Fig.7 Effect of enzyme additive amount on the reduction amount and deodorization rate of free amino acids

由图7可知，当加酶量为3%时，游离氨基酸的减少量明显多于其他4组，脱腥率也优于其他4组，最终综合考虑两个因素，确定最优条件为加酶量3%。

2.2.2.2 底物浓度的单因素筛选

Plastein反应与酶解反应的最大区别在于底物浓度的不同，Plastein反应的底物浓度较大，这样有利于缩合、转肽反应的进行。

图8 底物浓度对游离氨基酸减少量和脱腥率的影响Fig.8 Effect of substrate concentration on the reduction amount and deodorization rate of free amino acids

由图8可知，海参肠酶解液经过Plastein反应后，游离氨基酸减少量和脱腥率随底物浓度的增加呈先上升后下降的趋势。当底物浓度为20%时，游离氨基酸的减少量最多，脱腥率效果也最好，说明在此条件下，酶解液中的苦味肽段可能发生了缩合反应，从而改变了产品的风味。

2.2.2.3 酶解时间的单因素筛选

图9 反应时间对游离氨基酸减少量和脱腥率的影响Fig.9 Effect of reaction time on the reduction amount and deodorization rate of free amino acids

由图9可知，当反应时间控制在2 h时，游离氨基酸的减少量略高于其他4组，脱腥率随反应时间的变化较为明显，呈先增加后降低的趋势，当酶解时间为2 h时，脱腥效果较明显，2 h之后可能苦味肽的疏水性基团会暴露出来，使脱腥率开始下降。综合两个因素考虑，最终确定最优酶解时间为2 h。

2.2.2.4 反应温度的单因素筛选

图10 反应温度对游离氨基酸减少量和脱腥率的影响Fig.10 Effect of reaction temperature on the reduction amount and the rate of deodorization of free amino acids

由图10可知，当反应温度在50 ℃时，游离氨基酸的减少量更为明显；反应温度在50 ℃和60 ℃时，脱腥效果更为显著。游离氨基酸的减少量作为Plastein反应过程中的一种指示性指标，可以反映出游离氨基酸与肽的结合能力，结合能力越强说明Plastein反应越充分。综上，确定最优的反应温度是50 ℃。

2.3 响应面实验结果

对上述模型进行方差分析，结果见表 4和表5。

表4 响应面实验设计与结果Table 4 Response surface experimental design and results

表5 回归模型方差分析Table 5 Regression model variance analysis table

注：“*”表示显著，P<0.05；“**”表示极显著，P<0.01。

所建立的Plastein反应的模型P<0.0001，说明响应面回归模型达到极显著水平。所得到交互项AC及所有的二次项均极显著(P<0.0001)，BC显著(P<0.05)，说明加酶量和时间以及温度和时间的交互作用对游离氨基酸的减少量影响显著。P值越小，F值越大则说明相应变量的显著性越高，本次的模型中各变量对响应值影响的先后顺序依次为时间>加酶量>温度。此模型的相关系数R2=0.9826，校正后的相关系数RAdj2=0.9603，说明游离氨基酸的减少原因有98%取决于所选因素。

运用Design Expert 8.0.6 对表5 中的实验数据进行多元回归拟合，建立二次响应面回归模型方程为：Y=47.82-0.18A+0.163B-0.22C+0.86AB-3.29AC+1.35BC-4.47A2-3.99B2-4.66C2。

根据上述建立的回归方程可以绘制三维空间的响应曲面，结果见图11～图13。所拟合的相应曲面的形状和等高线可以直观地反映出各因素对响应值的影响趋势和两两变量之间的交互作用的程度[11,12]。

图11 温度与加酶量对游离氨基酸减少量交互影响的响应曲面Fig.11 Response surface of the interaction effect of temperature and enzyme additive amount on the reduction amount of free amino acids

图13 反应时间和反应温度对游离氨基酸减少量交互影响的响应曲面Fig.13 Response surface of the interaction effect of reaction time and reaction temperature on the reduction amount of free amino acids

经Design Expert 软件分析可得到Plastein反应的最优条件为中性蛋白酶量3.40%，底物浓度20%，反应时间1.69 h，反应温度57.08 ℃。综合单因素实验和实际操作情况，应用Plastein反应对海参肠进行脱腥的工艺确定为：选用中性蛋白酶，加酶量为3.40%，底物浓度为20%，反应时间为100 min，反应温度为57 ℃。在此条件下得到的游离氨基酸减少量为42.90%，预测值为43.98%，实际值与理论预测值相比相差了1.08%，说明该模型能很好地预测Plastein反应的游离氨基酸减少量[13]。

2.4 Plastein反应前后游离氨基酸组成

分别对海参肠的酶解液和最优条件下Plastein反应后的修饰物进行游离氨基酸组成的测定，具体组成结果见表6。

表6 Plastein反应前后氨基酸种类及含量的组成Table 6 Composition of amino acid types and content before and after Plastein reaction

氨基酸的组成对海参肠调味料的呈味起关键作用，对Plastein的酶解液和修饰物进行了游离氨基酸的测定，反应前后的氨基酸种类没有明显的变化，但是含量组成有较为明显的不同。经过Plastein反应后，必需氨基酸从反应前的45.67%增加到46.88%，说明该方法可以有效避免传统活性炭、酵母等方法脱腥使氨基酸损失的弊端[14]。反应后的6种呈味氨基酸(Gly、Ala、Asp、Thr、Ser和Glu)占总氨基酸含量的35.77%[15,16]，因此脱腥后的修饰物有一定的海鲜风味。有研究表明[17]，肽链中疏水氨基酸比例增加，会产生苦味，经过Plastein反应后游离氨基酸中的疏水性氨基酸含量均有增加，可见本来存在于海参肠肽链中的疏水氨基酸被置换出来，从而改善了海参肠调味料的味道。

3 讨论

海参肠具有高蛋白、低胆固醇，富含多种微量元素，是极具营养价值的海参加工副产物，但是其加工利用一直受其腥味的制约。赵晓玥以海参肠、卵为原料，采用中性蛋白酶与木瓜蛋白酶组合酶解和风味蛋白酶分步酶解的方法，获得口感、风味较好的酶解产物。

本研究首次采用酶法联合Plastein反应对海参肠进行脱腥，并制备海参肠调味料。目前，Plastein反应多用于提高生物活性肽的活性，韩青等人将该方法用于牡蛎ACE抑制肽的制备，有效提高了ACE的抑制率。沈晴晴[18]采用该方法制备海参ACE抑制肽，得到高活性的ACE抑制肽序列结构。

Plastein反应用于脱腥方面的研究比较少，现有的脱腥手段多是物理掩盖、吸附法和包埋法。张淼等[19]采用CaCl2和绿茶质量比为1∶1的复合脱腥剂对银鳕鱼进行脱腥，主要降低了鱼类中富含的三甲胺，防止氧化三甲胺的形成，从而阻止了腥味的产生。邢贵鹏等[20]采用紫苏叶、香芹液及白醋对罗非鱼加工副产物进行脱腥处理，主要是除去富含腥味的醛类、醇类等物质，脱腥处理后鱼体带有天然的植物香味，且保留了原有的风味。赵晓玥使用大孔树脂脱腥方法对海参肠进行脱腥处理，其方法原料损耗大，吸附效果不好，脱腥效率低。Plastein反应脱腥优势在于只加入食品级的酶，操作简单，而且不会造成蛋白质的损失，具有很好的应用价值。但Plastein反应脱腥的具体作用机理尚不是很明确，初步推测是通过重组、缩合等反应改变原有肽段的序列，从而改善了修饰物的风味，具体反应机理还需要后续实验进一步验证。

4 结论

本研究采用酶法联合Plastein反应对海参肠进行脱腥，制备出一种新型的海参肠调味料。海参肠调味料制备的最优酶解工艺为：风味蛋白酶，加酶量0.5%，酶解时间4 h，酶解温度50 ℃，料液比为1∶8。制备的海参肠酶解液通过Plastein反应进行脱腥处理，经响应面实验优化得到最佳的脱腥工艺为中性蛋白酶加酶量3.4%，底物浓度20%，温度57 ℃，时间100 min。对海参肠酶解液脱腥前后游离氨基酸组成和含量的分析表明，该方法确实改变了肽段的氨基酸组成，且不会造成氨基酸的损失。最终得到脱腥后的调味料味道鲜美，基本没有腥味。