微生物管碟法快速检测全价配合饲料中添加抗菌药物

杨修镇 李有志 徐恩民 张呈军

（山东省兽药质量检验所 山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点试验室 山东 济南 250022）

近年来我国畜牧养殖业集约化发展迅速，动物源性食品中兽药残留问题及耐药菌问题成为社会关注的焦点，农业农村部发布《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案(2018-2021年)》，开展兽用抗菌药物减量行动。农业农村部公告第194号[1]规定自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，自2020年7月1日起饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药除外)的商品饲料。全价配合饲料是养殖场最常见的饲料[2]，其添加抗菌药物情况也比较严重[3]，例如2019年11月21日《问政山东》就曝光了某非法饲料生产企业在饲料中添加恩诺沙星致使某养殖场的鸡蛋大批量被检出恩诺沙星残留的事件。微生物管碟法[4]是利用抗菌药物在摊布特定实验菌的固体培养基内呈球面形扩散，抑制实验菌的繁殖呈现出透明的抑菌圈的一种方法。全价配合饲料主要成分[5]为能量饲料、蛋白质饲料、矿物质饲料、维生素、氨基酸及微量元素添加剂，不含具有明显抗菌作用的物质，经提取后无法形成抑菌圈，基于此本文对微生物管碟法检测全价配合饲料中添加抗菌药物进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与样品 藤黄微球菌(Micrococcus luteus)由中国食品药品检定研究院提供，菌号为CVCC1600；全价配合饲料，购自山东六和饲料股份有限公司，包括猪配合饲料、鸡配合饲料、鸭配合饲料。

1.1.2 抗菌药物对照品或标准品与试剂 对照品或标准品购自中国兽医药品监察所，主要包括氟喹诺酮类对照品：恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星；四环素类对照品：土霉素、四环素、多西环素、金霉素；β内酰胺类对照品：阿莫西林、氨苄西林；氨基糖苷类标准品：庆大霉素、安普霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、大观霉素；大环内酯类标准品：红霉素、泰乐菌素、替米考星；磺胺类对照品：磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺喹噁啉；林可霉素对照品；氟苯尼考对照品；硫酸黏菌素标准品；抗生素检定培养基ⅠⅠ(pH6.5～6.6)、灭菌缓冲液(pH 6.0)购自上海远慕生物科技有限公司；水为一级水，其余试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备 AE-240电子天平(Mettler公司)、PB－10酸度计(北京赛多里斯仪器系统有限公司)、KQ3000超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)、CF16RXⅠⅠ离心机(日立工业株式会社)、GNP-9160恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司)、ZY-300Ⅳ抑菌圈自动测量分析仪(北京先驱威锋技术开发公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 取研细后的全价配合饲料2g，精密称定，置50ml离心管中，加灭菌缓冲液20ml，超声提取5min(40KHz)，8000rpm离心5min，取上清液，备用。

1.2.2 标准品溶液配制 取各抗菌药物对照品或标准品10mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加灭菌缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置10ml容量瓶中，加灭菌缓冲液至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 藤黄微球菌悬液的制备[6]取藤黄微球菌的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24h，用0.9%灭菌氯化钠溶液5ml将菌苔洗下，备用。

1.2.4 管碟的制备[6]取直径约90mm高16～17mm的平底碟，注入灭菌后融化的培养基ⅠⅠ(pH6.5～6.6)20ml，使在碟底内均匀摊布，放在水平台上使凝固，作为底层。另取灭菌后融化的培养基适量，放冷至48～50℃，加入藤黄微球菌悬液适量，摇匀，每碟加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在碟中心位置放置一不锈钢小管(内径为6.0±0.1mm，高为10±0.1mm，外径为7.8±0.1mm)，用陶瓦圆盖覆盖备用。

1.2.5 菌层菌浓的选择 取1.3.2中各标准品溶液各290µl加入1.3.4制备的管碟中(每碟仅加一种抗菌药物标准品溶液)，用陶瓦圆盖覆盖，置恒温培养箱中36±1℃培养16h，测量抑菌圈大小，抑菌圈直径18～20mm时的菌浓为适宜菌浓。

1.2.6 阴性对照试验 取研细后的全价配合饲料(未添加抗菌药物)，按照1.2.1制备样品溶液，吸取290µl加入经1.2.4和1.2.5制备的管碟中，用陶瓦圆盖覆盖，置恒温培养箱中36±1℃培养16h，观察是否出现抑菌圈。

1.2.7 阳性对照试验 取全价配合饲料，按100mg/kg分别加入各抗菌药物，混匀，研细，按照1.3.1制备样品溶液，吸取290µl加入经1.2.4和1.2.5制备的管碟中，用陶瓦圆盖覆盖，置恒温培养箱中36±1℃培养16h，观察是否出现抑菌圈。

1.2.8 检出限 取全价配合饲料，分别加入一定量的各抗菌药物，混匀，研细，按照1.2.1制备样品溶液，吸取290µl加入经1.2.4和1.2.5制备的管碟中，用陶瓦圆盖覆盖，置恒温培养箱中36±1℃培养16h，测量抑菌圈大小。出现明显抑菌圈(≥钢管外径3mm，即抑菌圈直接≥10.8mm)时的各抗菌药物加入量为检出限。

2 结果

2.1 菌层菌浓的选择

按1.3.5的方法反复试验，各抗菌药物的适宜菌浓见表1。

2.2 阴性对照试验和阳性对照试验

各全价配合饲料提取液均未出现抑菌圈，按100mg/kg加入各抗菌药物后均出现直径18～20mm的抑菌圈。

表1 各抗菌药物适宜的藤黄微球菌浓度(每100ml灭菌培养基加入菌悬浮液体积) (ml)

2.3 检出限

全价配合饲料添加抗菌药物的检出限见表2。

表2 全价配合饲料添加抗菌药物的检出限 (mg/kg)

3 讨论与小结

（1）饲料中添加抗菌药物的检测方法多为高效液相色谱法和高效液相色谱－串联质谱法[7]，高效液相色谱法大多采用保留时间和紫外光谱匹配定性，高效液相色谱－串联质谱法采用保留时间和两对离子的相对丰度比定性，两者相比较高效液相色谱－串联质谱定性更为准确，但无论是高效液相色谱法还是高效液相色谱－串联质谱法都是一种定向筛查方法，需要借助昂贵的仪器。目前对全价配合饲料中添加抗菌药物关注度较高的除了主管部门和相关检验机构外还有养殖企业，养殖企业在不知情的情况下使用带有抗菌物质的饲料，会致使畜禽产品兽药残留超标带来巨大的经济损失，并会加速耐药菌株的产生，导致动物机体免疫力下降，诱发各种疾病的产生与流行[8]。（2）菌种选择时考察了对常见抗菌药物敏感的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠埃希菌，经反复试验发现藤黄微球菌对各抗菌物质响应较好，菌浓容易掌控，不受全价配合饲料提取液影响，因此选择藤黄微球菌作为检验用菌种。（3）全价配合饲料为营养成分，不具有抗菌作用，这是与抗菌药物的最大区别，微生物管碟法可以简单有效的筛查全价配合饲料中是否有添加抗菌药物。尽管该方法无法确定被添加物是何种药物，无法对其精确定量，但养殖企业关心的往往不是这些。养殖企业缺少相关精密大型仪器设备，需要用最简单的方法确定全价配合饲料中是否添加抗菌药物。本试验建立的全价配合饲料中添加抗菌药物检查方法简便、快速、无需大型精密仪器，适用于高通量筛查，满足基层养殖企业需求。